这是关于CO2培养的三部分系列中的**篇
生物污染是每个使用细胞培养的人的恐惧。当培养物被微生物感染或被外来细胞交叉污染时，这些培养物通常必须被破坏。由于培养物污染的来源是普遍存在的以及难以鉴定和消除，所以没有细胞培养实验室不受这种担心的影响。随着细胞培养物用于生物研究，疫苗生产和用于个性化医疗和新兴再生医学应用的治疗性蛋白质的生产的持续增加，培养物污染仍然是非常重要的问题。
介绍
细胞培养正在继续60年的趋势，在学术研究，治疗医学和药物发现中越来越多地使用和重要性，伴随着放大的经济影响。1,2新的治疗，疫苗和药物，以及再生和合成器官，将日益来自培养的哺乳动物细胞。随着细胞培养技术的更大的使用和熟练，更好地理解与细胞培养物污染相关的危险和问题。在21世纪，有更好的测试方法和预防工具，并且对污染的风险和影响的认识要求细胞培养者保持警惕; 未检测到的污染可能具有广泛的下游效应。
生物污染：一个常见的伴侣
在1928年青霉素的机会发现是罕见的事件，大多数研究人员只能梦想。从一个暑假返回后，他不小心留下了一套在实验室角落堆积的培养皿，亚历山大·弗莱明发现了20世纪**强大的药物之一。弗莱明注意到他的一个细菌培养物被真菌污染，但是真菌周围的葡萄球菌的菌落已被破坏。真菌当然是Penicillium notatum，弗莱明继续发现抗生素。然而，这是污染的一个非常罕见的例子，实际上推动了科学研究的道路。在大多数情况下，文化的污染仍然是每一个科学家**糟糕的噩梦。Carolyn Kay Lincoln和Michael Gabridge在1998年总结了这个问题：“细胞培养污染仍然是基础研究工作台以及生物制品制造商的主要问题。污染是真正危及使用细胞培养作为可靠的试剂和工具。“ 3
哺乳动物细胞培养物的生物污染比你想象的更常见。在20世纪90年代中期报道的统计数据显示，美G实验室中11％**15％的培养物感染了支原体物种。4即使有更好的认识到问题和商业准备试剂和媒体的更严格的测试，研究实验室培养支原体生长的发病率在**近一项研究中，23％5，2010年文化的一个惊人的8.45％的市场来自生物制药测试来源被真菌和细菌污染，包括支原体。6
在研究实验室，污染不仅仅是偶尔的刺激，但它可以花费宝贵的资源，包括时间和**。**终，污染会影响研究团体或特定科学家的可信度; 出版物有时必须撤回，因为担心回溯性样品污染或报告的结果是伪像。在生物制药制造中，当整个生产运行必须被丢弃时，污染可以具有甚**更显着的效果。因此，了解样品污染如何发生以及可用于限制和**终防止样品污染的方法是非常重要的。
什么原因导致生物污染？
生物污染物可以分为两个亚类，取决于在培养物中检测它们的容易性，**简单的是大多数细菌和真菌。那些更难以检测，从而存在潜在的更严重的问题，包括支原体，病毒和其他哺乳动物细胞的交叉污染。
细菌和真菌
细菌和真菌，包括霉菌和酵母，在环境中是普遍存在的，并且能够在富含细胞培养环境中快速建群和繁殖。它们的小尺寸和快速生长速率使得这些微生物是**常遇到的细胞培养污染物。在不存在抗生素的情况下，通常通过显微镜观察或通过它们对培养物的直接作用（pH变化，混浊和细胞死亡）在污染的几天内在培养物中检测细菌。酵母通常导致生长培养基变得非常混浊或浑浊，而霉菌将产生分枝的菌丝体，其**终表现为漂浮在培养基中的毛丛。
支原体
支原体肯定是所有生物污染物中**严重和**普遍的，因为它们的低检测率及其对哺乳动物细胞的作用。虽然支原体在技术上是细菌，但它们具有使它们独特的某些特征。它们比大多数细菌（0.15**0.3μm）小得多，因此它们可以生长**非常高的密度，没有任何可见的迹象。它们还缺乏细胞壁，并且与它们的小尺寸相结合意味着它们有时可以滑过用于灭菌的滤膜的孔。由于**常见的抗生素靶向细菌细胞壁，所以支原体是抗性的。
支原体对任何细胞培养物都是非常有害的：它们影响宿主细胞的代谢和形态，引起染色体畸变和损伤，并且可以引起细胞病变反应，使来自污染培养物的任何数据不可靠。在欧洲，已经发现支原体污染水平极高 - 在25％和40％之间 - 日本报告的比率高达80％.4美G和世界其他地区之间的差异可能是由于使用测试程序。统计显示，常规检测支原体污染的实验室发病率低得多; 一旦检测到，可以包含和消除污染。支原体的测试应**少每月进行一次，并且有广泛的市售试剂盒。确保物种检测的**方法是使用**少两种不同的测试方法，例如DAPI染色和PCR。5
病毒
像支原体，病毒不提供视觉提示他们的存在; 它们不改变培养基的pH或导致浑浊。由于病毒使用其宿主进行复制，因此用于阻断病毒的药物对所培养的细胞也具有高毒性。然而，对宿主细胞造成损害的病毒倾向于是自限性的，因此病毒污染的主要问题是它们感染实验室人员的可能性。那些使用人类或其他灵长类动物细胞的人必须采取额外的安全预防措施。
其他哺乳动物细胞类型
细胞培养物与其他细胞类型的交叉污染是一个严重的问题，其**近才被认为是令人担忧的。7,8据估计，目前使用的15％**20％的细胞系被错误识别9,10，这是从**个人类细胞系HeLa开始的一个问题，HeLa是从Henrietta Lacks在1952年分离的异常侵袭性子宫颈腺癌。HeLa细胞所以积极，一旦偶然引入一种文化，他们很快过度生长的原始细胞。但问题不仅限于HeLa; 存在许多被表征为内皮细胞或前列腺癌细胞但实际上是膀胱癌细胞的细胞系的实例，其特征为乳腺癌细胞，但实际上是卵巢癌细胞。在这些情况下，当外源细胞类型更好地适应培养条件时，出现问题，并且因此替代培养物中的原始细胞。这种污染明显地对所产生的研究的质量提出了问题，并且使用包含错误细胞类型的培养物可能导致公开结果的收回。
实验室中的生物污染源
为了减少生物污染的频率，重要的是要了解生物污染物如何进入培养皿。在大多数实验室中，微生物的**大来源是伴随实验室人员的微生物。这些在正常实验室工作期间作为空气悬浮颗粒和气溶胶循环。说话，打喷嚏和咳嗽可以产生大量的气溶胶。服装也可以从实验室外携带和运输一系列微生物，因此在细胞培养实验室工作时穿戴实验室外套是**关重要的。即使只是在实验室周围移动也可以产生空气运动，所以房间必须经常清洁以减少灰尘颗粒。
某些实验室设备，例如移液装置，涡流器或没有生物容器的离心机可以产生大量的载有微生物的颗粒和气溶胶。经常使用的实验室设备，包括水浴，冰箱，显微镜和冷藏室，也是微生物和真菌的储存库。不适当清洁和维护的培养箱可以作为真菌和细菌的可接受的家。在灭菌过程中在高压釜中材料的过度拥挤也可导致微生物的不完全消除。
培养基，牛血清，试剂和塑料制品也可以是生物污染物的主要来源。虽然商业测试方法比早期几十年有所改进，但使用经认证可用于细胞培养的材料是**关重要的。在同时使用多个细胞系时可能发生交叉污染。每个细胞类型应该有自己的解决方案和供应，应该与其他细胞分开操纵。在常规细胞培养程序中非故意使用非消毒用品，培养基或溶液是微生物扩散的主要来源。
结论
污染是细胞培养中的普遍问题，并且有效地管理任何风险以维持实验完整性是**关重要的。抗生素可以使用几周，以确保已知的微生物污染的解决; 然而，应避免常规使用。定期包含抗生素不仅选择耐药性生物，而且还掩盖了无菌技术中的任何低水平感染和习惯性错误。
对抗污染的**佳方法是每个人保留所有细胞培养工作的记录，包括每个通道，一般细胞外观和操作，包括细胞的进食，分裂和计数。如果发生污染，请记录特性，时间和日期。以这种方式，任何污染物可以在其发生时被定位，并且可以对无菌技术或实验室规程进行改进。在本系列的下一篇文章中，我们更详细地探讨了污染预防的有效措施，特别是二氧化碳培养箱的关键作用。
参考文献
