**节 细胞培养在分子生物学中应用
分子生物学是在生物化学、遗传学、免疫学、微生物学、细胞生物学、生物物理学等学科结合的基础上，经过相互杂交、相互渗透融合发展起来的一门新兴学科，它从分子水平上研究生命现象的本质以及活动规律，以达到造福人类的目的，主要侧重于研究基因的结构和功能、分子间信号传递和调控。
基因在细胞中的表达在时间和空间上具有高度的特异性；细胞的运动、迁徙、粘着、分化的控制机制需要从分子水平上阐明；肿瘤的发生和发展的机制有待于深入研究；人类基因组计划已于2000年６月完成人类基因组草图，科学家发现人类基因数目约为3万个左右，仅比果蝇多２万个，远少于原先10万个基因的估计。2003年4月14日，G际人类基因组测序组织正式对外宣布：美、英、日、法、德和中G科学家经过13年努力共同绘制完成了人类基因组序列图，人类基因组计划的所有目标均已实现。目前基因功能比较清楚的有10 000条左右，还有大量的基因功能不明；基因的功能需要以细胞为载体，细胞为这些研究提供了研究的对象和材料。
鄂征等将以研究体外培养的细胞为主要研究对象的分子生物学技术，称为分子细胞学技
术。细胞是由多种生物大分子如核酸、蛋白质、类脂等组成并由它们行使各种功能活动，只有通过对它们的研究，才能了解细胞的基本活动规律。
对其的研究技术可以分为三类，一是分离提取研究；二是基因导入研究；三是原位检测研究。
一、分离提取研究
根据分离物质的种类分为DNA提取、RNA提取、蛋白质提取。
1．DNA提取 在分子生物学研究中，DNA是这些技术应用的主要对象，所以从真核细胞中分离DNA是分子生物学研究中很重要的基本技术，DNA样品的质量直接关系到实验成功与否。真核细胞95％的DNA存在于细胞核中，DNA与蛋白质结合在一起，构成染色质的**结构，另有5％存在于细胞器（线粒体）中。提取DNA的方法比较多，但基本原理是一样的，即去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类生物大分子，去除其他不必要的核酸分子，沉淀DNA，去除盐类、有机溶剂等杂质，**后纯化核酸。
方法一：酚抽提法
【材料】
磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4），DNA抽提缓冲液，10mmol/L Tris-Cl（pH8.0），0.1mol/L ED-TA（pH8.0），20μg/ml RNase A，0.5％SDS，蛋白酶K 20mg/ml，酚（Tris-C1 pH8.0，饱和），NH4Ac 10mol/L，TE（10mmol/Tris-Cl（pH8.0），1mmol/L EDTA（pH8.0）），无水乙醇。
【操作过程】
（1）收集细胞，对于悬浮培养的细胞可以直接经1500g离心，用PBS洗涤一次，再次离心去上清；对于贴壁培养的细胞，用胰酶消化后再离心收集，用PBS液洗涤一次后，再次离心，弃上清，收集细胞。
（2）在有细胞沉淀的离心管中加入DNA抽提缓冲液l0ml，37℃ 1小时。
（3）加入50μl 20mg/ml的蛋白酶K，50℃保温3小时。
（4）加入等体积的酚，上下颠倒混匀，直**水相与酚相混匀成乳状液。
（5）室温，5000g离心15分钟，将水相转移到另一离心管中，重复酚抽提二次。
（6）转移水相，加入0.2倍体积的10mol/L NH4Ac，2倍体积的无水乙醇混匀，可立即看到乳白色丝状沉淀，弃去上清，立刻用70％乙醇漂洗沉淀。
（7）室温，5000g离心5分钟，弃上清，室温让乙醇挥发干净。溶于适量的TE中。
（8）测定DNA的含量和纯度。
【注意事项】
（1）此法可以用于提取5×107个细胞，可得产量为200μg。
（2）高分子量DNA提取过程中，取上层DNA，往往会牵动水相与酚相的界面蛋白质层，可以将Tip头剪去一段，这样**的口径增大，缓慢吸取水相。
（3）在DNA抽提缓冲液中加入高浓度的RNase A，可以省去DNA沉淀后再次用RNaseA消化残留的RNA。
（4）此方法可分离100～200kb左右的基因组DNA，适用于λ噬菌体作为载体的基因组文库的构建、脉冲场电泳、酶切分析、Southern杂交、PCR检测等实验。
方法二：甲酰胺解聚法
【材料】
DNA抽提缓冲液：10 mmol/L Tris-C1（pH8.0），0.1mol/L EDTA（pH8.0），20μg/ml RNase A,0.5％SDS。蛋白酶K 20mg/ml。变性缓冲液：80％去离子甲酰胺，0.8mol/L NaCl，20mmol/Tris-C1（pH8.0）。透析液1：0.1mol/L NaCl，20mmol/L Tris-Cl（pH8.0），l0mmol/L EDTA（pH8.0）。透析液2：10mmol/L NaCl，l0mmol/L Tris-Cl（pH8.0），0.5mmol/L EDTA（pH8.0）。
【操作程序】
（1）细胞的收集及蛋白酶K消化同酚抽提法。
（2）当蛋白酶K消化后，将溶液冷却**0℃，加入10ml变性液缓冲液，放置15℃过夜。
（3）将液体转移**1个火棉胶袋中，先用透析液1透析，每次1L，换液4次；然后用透析液2透析，换液6次，每次700ml。
（4）直到DNA溶液中A260/280的值稍大于1.75，若低于1.75则需继续透析。
（5）根据0D260计算DNA的含量，用脉冲场电泳分析DNA分子量的大小。#p#分页标题#e##p#分页标题#e#
【注意事项】
（1）此法是裂解细胞和消化蛋白后，利用高浓度的甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，然后透析处理DNA样品，由于提取过程中操作步骤少，对DNA的机械损伤比较小，DNA分子量可达200kb左右。其用途同酚抽提法。
（2）对于5×107个细胞，使用本法，**后的溶液体积为20ml，浓度为5～10μg/ml，在此浓度下，其溶液仍然很粘稠，说明DNA的分子量比较大。
方法三：Trlzol法
此法利用DNA和RNA在溶液中的分布不同将其分开，RNA分布在水相中，而DNA分布在有机相中，用乙醇将DNA沉淀下来。
【材料】
Trizol试剂，含0.1mol/L柠檬酸钠的10%乙醇，无水乙醇，8mmol/L NaOH。
【操作程序】
（1）收获细胞5×106个，方法同前。
（2）在含有细胞团的Eppendorf管中加入1ml Trizol试剂，振荡混匀，室温放置5分钟。
（3）加氯仿0.2ml，振荡混匀，室温放置2分钟。
（4）4℃，12 000g离心15分钟，小心吸取上层水相，移人另一Eppendorf管中（用于RNA 提取）。
（5）在有机相中加入0.3ml的无水乙醇，混匀，室温放置2～3分钟。
（6）4℃，10 000g离心5分钟。
（7）吸去上清（用于蛋白质的提取），用1ml含0.1mol/L柠檬酸钠的10%乙醇漂洗DNA。
沉淀2次。在每次漂洗过程中，使DNA沉淀在溶液中保持30分钟，其间不断用手指振荡。**后4℃，10 000g离心5分钟收集DNA沉淀。
（8）用75％乙醇洗涤沉淀1次。
（9）空气中干燥DNA沉淀（不要作真空干燥，也不要过度干燥，否则很难溶），用600μl 8mmol/L NaOH溶解DNA沉淀。
（10）此时，DNA沉淀中可能含有一些胶状不溶物，可以将其在4℃，12 000g以上离心10分钟，取上清。
2．RNA提取 在研究基因表达及其调控、cDNA合成、cDNA文库的构建过程中，RNA的提取是必不可缺少的一步。在哺乳动物细胞中，平均每个细胞含有10-5μg RNA。对于培养的细胞而言，lg细胞相当于lml压积的细胞，大约108个左右。在细胞质总RNA中，rRNA占80％～85％，mRNA占1％ ~ 5％，余下的为tRNA和核内小分子RNA。其中mRNA分子种类繁多，分于量大小不一，在细胞内含量少，它是蛋白质合成的直接模板，是分子生物学中基因表达研究的主要对象。jue大多数mRNA分子（除血红蛋白、干扰素和有些组蛋白mRNA以外）的3’端存在着20 ~ 250个多聚腺苷酸（PolyA）。利用此特征，可很方便地从总RNA中，用寡聚（dT）亲合层析柱分离出mRNA。
RNA的分离关键因素是尽量减少RNA酶的污染。RNA酶是一类生物活性非常稳定的酶，除细胞内RNase以外，环境中的灰尘、各种实验器皿和试剂、人体的汗液以及唾液中均存在RNase。这类酶耐热、耐酸、耐碱，蛋白质变性可使之暂时性失活，但在变性剂去除后，又可恢复活性。所以在实验操作的过程中，应尽量减少RNase污染的机会。在整个操作中，在一个洁净的环境中，带手套和口罩，所用的器皿、水和试剂需用DEPC（焦碳酸二乙酯，是很强的RNase抑制剂）处理过。
玻璃器皿的处理。在常规洗净后，应用0.1％DEPC浸泡2小时以上，再用双蒸水漂洗几次，高压消毒去除DEPC，然后250℃烘烤4小时以上。塑料器材应用一次性、新的，如Eppendoff管、Tip头等，在使用前高压消毒，严格一些可以用0.1%DEPC浸泡过液，高压消毒。所用试剂应加DEPC**0.05％ ~ 0.1％，室温过液，然后高压处理。但要注意，DEPC易与Tris反应，所以在配制Tris时，应用DEPC处理过的水配制，**后再一次高压消毒。
方法一：异硫氰酸胍、酚、氯仿一步法
此方法将已知**强的RNase抑制型异硫氰酸胍、9-巯基乙醇和去污剂N-十二烷基肌氨酸钠联合使用，抑制RNA的降解，增强了对核蛋白体复合物的解离，提高了RNA的产率。RNA选择性地进入无DNA和无蛋白质的水相，容易被异丙醇沉淀浓缩，比较适合于大量或少量的细胞RNA提取。用此种方法提取的RNA可用于Northern杂交、cDNA的合成、体外翻译、RT-PCR等。
【材料】
(1) DEPC处理水。
(2) 0.75mol/L柠檬酸钠：称取柠檬酸钠（Na3C6H7·2H2O）22g，溶于70ml水中，以浓HCl调pH**7.0**100ml，高压灭菌。
(3) 10％十二烷基肌氨酸钠（sodium laurylsarcosine）：称取10g十二烷基肌氨酸钠,溶于90ml水中，65℃助溶，定容**100ml。
(4) GSS缓冲液：用293ml 水溶解250g异硫氰酸胍，加入17.6ml 0.75mol/L柠檬酸钠，26.4 ml 10％十二烷基肌氨酸钠，滤过除菌。
(5) 变性缓冲液：在用时mi GSS缓冲液加入100社琉基乙醇
(6) 酚（水饱和）；在100ml重蒸酚中，加入30mlDEPC处理水，磁珠搅拌混匀，直**酚相与水相形成明显的界面。
(7)2mol／L NaAc（pH4.0）。
(8)氯仿：异戊醇（49 : 1）。
(9)PBS缓冲液（DEPC处理水配制）。
【操作程序】
(1) 收集细胞5×106个，方法同DNA提取。
(2) 在含有细胞团的Eppendoff管中加入0.5 ml变性缓冲液，振荡混匀。
(3) 加入50μl 2mol/L NaAc，混匀后，加入0.5ml水饱和酚，再加入100μl氯仿/异戊醇，振荡混匀后置于冰上15分钟。
(4) 4℃12 000g离心15分钟。
(5) 小心吸取上清，转移**另一Eppendoff管中，加等体积的异丙醇，混匀后，置于-20℃**少一小时。在吸取上清时，不能接触水相与酚相的界面，此界面为蛋白质层，酚相中主要为DNA。#p#分页标题#e##p#分页标题#e#
(6) 4℃，12 000g离心15分钟，弃上清，加入150μl变性液，振荡溶解沉淀（沉淀中含有RNA）。加入150μl异丙醇，置于-20℃，1小时。
(7) 4℃，12 000g离心15分钟，弃上清（如不立即用，可以将此置于-70℃，长期保存）。
(8) 冰浴冷的75％乙醇漂洗沉淀；4℃，12 000g离心5分钟，弃上清（小心不要将沉淀倒掉）。
(9) 真空干燥．去除样品中的乙醇（但不宜完全干燥，否则沉淀难以溶解）。
(10) 用适量的DEPC处理水溶解沉淀，测定OD260、280、230，计算RNA的含量和纯度，同时取大约150ng总RNA电泳检测完整性。可以用非变性的琼脂糖凝胶，EB染色后，可以见到有3条明显RNA带，分子量大的两个分别为28S和18S，带的亮度比为2︰1，如果小于此值，说明RNA存在着降解；如用甲醛变性胶电泳，则需要比较大的上样量。
【注意事项】
(1) RNA的含量计算：X(μg/μl)=OD260×40×稀释倍数/1000，OD260加为波长260nm时吸光度值。
(2) 通常纯的RNA，OD260/OD280 =2.0，由于所用的标本不同，此数值在1.7 ~ 2.0范围内波动。若低于此值说明有蛋白质污染，此样本应再经酚/氯仿/异戊醇抽提一次。有时样本此值大于2.0，如重复测定无误，并不表明纯度有问题。RNA样品OD260/OD230常大于2.0，低于此值表示有异硫氰酸胍污染，此时样品需经异丙醇沉淀，以除去小分子胍类的污染。
方法二：Trizol 试剂提取
Trizol试剂提取RNA的方法是由Invitrogen公司推出的新产品，其操作简单、方便，在1小时即可完成，所制备的RNA可以用于Northern杂交和cDNA的合成。此种方法，还有一个优点，它可以同时分离DNA、RNA和蛋白质。如果对一个很少的标本要进行这三种物质分析，Trizol试剂是**佳的选择。
【材料】
Trizol试剂，氯仿，异丙醇，75％的乙醇，DEPC处理水，PBS缓冲液。
【操作程序】
(1) 收获细胞5×106个，方法同DNA提取。
(2) 在含有细胞团的Eppendorf管中加入1m1Trizol试剂，振荡混匀，室温放置5分钟（为了获得好的结果，可在15℃水浴中进行）。
(3) 加氯仿0.2ml，振荡混匀，室温放置2分钟。
(4) 4℃，12 000g离心15分钟，小心吸取上层水相，移人另一Eppendorf管中（不可触及中间层的蛋白质界面）。
(5) 加入等体积的异丙醇，置室温10分钟。
(6) 4℃，12 000g离心15分钟，弃上清。
(7) 冰浴冷的75％乙醇漂洗沉淀；4℃，12 000g离心5分钟，弃上清。
(8) 真空干燥，去除样品中的乙醇，用适量的DEPC处理水溶解沉淀，测定OD260、280，计算RNA的含量和纯度，同时取大约150ng总RNA电泳检测完整性。
【注意事项】
此两种方法是目前常用且比较简单的RNA提取方法，在提取的时候，**好是先计算细胞的数目，决定变性液或Trizol试剂的用量，如果细胞数目过多，常出现在RNA中有蛋白质和DNA的污染。不论采用何种方法，都很难保证没有DNA污染，在做RT-PCR时将出现非特异性扩增和杂带，所以推荐在RNA提取后，用DNAseI（无RNase活性）消化DNA，获得高纯度的RNA。如果从转染有质粒或病毒的细胞，则必须用DNAseI消化。
3．蛋白质提取 蛋白质是基因的**终产物，是功能的执行者。在研究中需从细胞中提取蛋白质进行酶的活性分析和产物鉴定。下面介绍同和种常用的方法。
方法一：SDS-超声
此种方法利用SDS裂解细胞，再用超声的方法断裂DNA，所获得蛋白质溶液可以用于SDS-PAGE分析和Western blot。
【材料】
1×SDS加样缓冲液：50mmol/L Tris-Cl （pH6.8），100mmol/L DTT（二硫苏糖醇），2％SDS，0.1％溴酚兰，10％甘油。PBS缓冲液。
【操作程序】
(1) 弃细胞培养基，用PBS洗涤细胞2次。
(2) 用橡胶刮下细胞（不要用胰蛋白酶消化），加入适量的PBS缓冲液，离心收获细胞。
(3) 在含有细胞团的离心管中加入150μl 1×SDS 加样缓冲液，此时溶液比较粘稠，是由于大量基因组的DNA的释放。
(4) 将上述溶液煮沸5～10分钟。
(5) 用超声波打碎染色体DNA，直到溶液不粘稠为止。
(6) 室温下10 000g离心10分钟，取上清到另一个离心管中。
(7) 测定蛋白质浓度。所得溶液可以用SDS-PAGE分析和Western blot。
方法二：Trizol法
Trizol试剂除了可以分离DNA和RNA外，还可用于蛋白质的提取。
【材料】
含0.3mol/L盐酸胍的95％乙醇。
【操作程序】
(1) 在Trizol法DNA提取过程中⑦的上清（酚和乙醇相）中，加入1.5ml的异丙醇，室温10分钟。
(2) 4℃，12 000g离心10分钟。
(3) 弃上清，用含0.3mol/L盐酸胍的95％乙醇溶液洗涤沉淀3次。在每次洗涤过程中，沉淀在溶液中保持20分钟。
(4) 4℃，10 000g离心5分钟。
(5) 用2ml的无水乙醇洗涤沉淀1次，4℃，10 000g离心5分钟。
(6) 吸去上清，真空干燥，用1％SDS溶解蛋白质沉淀。
(7) 4℃，12,000g离心10分钟除去非需物质，转移上清（即含蛋白质的溶液）。
【材料】
细胞裂解液：Tris-Cl （PH 8.0） 50mmol/L，NaCl 150mmol/L， 0.02％Na3N，PMSF 100μg/ml，1％ Triton X-100，PBS缓冲液。#p#分页标题#e##p#分页标题#e#
【操作程序】
(1) 离心收获对数期生长细胞，用PBS洗涤细胞2次。
(2) 向细胞沉淀加入800μl细胞裂解液，4℃放置30分钟（为了进一步破碎细胞，可用超声破碎机粉碎)。
(3) 4℃、12 000g离心30分钟，吸上清，即为蛋白质液。
【注意事项】
此种方法用了蛋白酶抑制剂PMSF（苯甲酰磺酰氟），没有应用蛋白质变性剂，所以此法所得的蛋白质液可以用于酶的活性分析，但其和Na3N有剧毒，实验操作要小心，实验过程中要带手套谨慎操作。
二、基因导入
当一个基因被克隆后，研究者总是希望将其转染到真核细胞中进行研究其功能、表达调控、分离蛋白质产物等。所有这些目的，都必须具有将DNA有效地导入细胞的能力。目前基因导入技术已经广泛地用于基因结构与功能分析，基因表达与调控、基因治疗与转基因动物研究，已经成为分子生物学研究的一种常用的手段。
这里介绍几种常用的细胞基因转染的方法。
方法一：脂质体转染
转染用试剂脂质体Lipofeetin和Lipofectamine是由Invitrogen 公司推出的**代产品和第二代产品。Lipofectamine与Lipofectln相比，毒性更小，转染效率更高，特别适合于一些转染的细胞，如HeLa、COS-7、NIH3T3、PC12D等。脂质体是一种特制的阳离子脂质试剂，其与靶DNA的磷酸骨架结合而成的复合物，具有能轻易通过细胞膜从而完成转染过程的特性。可转染DNA、RNA和寡核苷酸**各种细胞，并将DNA导入植物原生质体。目前在研究基因功能方面，出现一个新的技术是RNA干扰试验（RNA interference）,在操作过程中，是将21 ~ 25nt寡核糖核酸双链分子转染细胞，从而稳定、特异性去除某一个基因的表达，然后从细胞的表现中推测未知基因的功能。所用的转染试剂就是Lipofectamine。脂质体适用于各种类型的贴壁生长和悬浮培养的细胞，其介导的转染效率是磷酸钙沉淀法德5 ~100倍。
1．贴壁细胞转染方法
【材料】
脂质体，不完全培养基（RPMI 1640），完全培养基（含15％胎牛血清）。
【操作程序】
(1) 质粒的制备：由于用于转染的质粒量比较大，所需的纯度也较高，而且质粒的构型**好是共价闭环的。所以推荐采用质粒DNA大量制备，而且在操作过程中要轻柔。提取的质粒需进行纯化，如用氯化铯密度离心法、聚乙二醇沉淀法。目前市上所售的一些质粒提取和纯化的试剂盒可以达到基因转染的要求，并且操作比较简单、快捷。在质粒纯化的**后一步质粒沉淀时，应是无菌操作，70％的乙醇漂洗，无菌超净台内吹干，溶于无菌水中。
(2) 收获细胞：将（1 ~ 2）×105个细胞重悬于2ml完全培养基中，转种于35mm培养皿中或6孔培养板中。
(3) 37℃，5％CO2培养箱培养18 ~ 24小时，使细胞达50％～80％的融合。
(4) 在Eppendorf管中，制备下列溶液：A溶液：将2～20μg质粒DNA溶于100μl RPMI 1640培养基中。B溶液：Lipofectin[Lipofectin(μl)：DNA（μg）约为2.5:1 ]稀释于 RPMI l640培养基中,**终体积100μl。
(5) 合并A溶液和B溶液，轻轻混匀，置于室温15分钟。
(6) 弃去培养皿或培养板中的细胞培养液，并用无血清培养基洗涤细胞一次。
(7) 加0.8ml无血清培养基**Lipofectin-DNA混和物中，混匀后，小心滴在细胞上，轻轻混匀。
(8) 37℃，5％CO2培养箱培养5～24小时（这个时间要根据细胞耐受无血清培养时间而定）。
(9) 弃去转染液，加入2ml完全培养基，继续培养.
(10) 转染后48～72小时，测定细胞瞬时表达情况，如用于稳定表达，可于转染48小时后更换选择培养基进行筛选。
2．悬浮细胞一过性转染方法
【材料】
同贴细胞转染方法。
【操作程序】
(1) 质粒的制备同上。
(2) 收获细胞，用无血清培养基洗涤细胞1次。
(3) 将（2 ~ 3）×106个细胞重悬于0.8ml无血清培养基中，接种于6孔板或35mm培养皿中。
(4) 参照贴壁细胞转染方法(4)、(5)进行制备Lipofectin-DNA混和物。
(5) 将制备的Lipofectin-DNA混和物加入细胞悬液中，轻轻混匀，置37℃，5%CO2培养箱培养5 ~ 24小时。
(6) 加4ml完全培养基继续培养。
(7) 转染48 ~ 72小时后，室温200g，离心5分钟收获细胞。测定细胞瞬时表达情况。
Lipofectamine与Lipofectin转染的方法基本相同，不同公司的产品有稍许不同，请参照其产品说明书进行，表13-1列出不同直径的培养皿的转染过程所需的试剂量。
表13-1 不同培养皿所需试剂量
|
培养皿直径 |
脂质混合物 |
Lipofectamine或Lipofectin(μl) |
DNA |
无血清培养基 |
|
35 |
100 |
2-25 |
1-2 |
0.8 |
方法二：磷酸钙沉淀法
此法是研究基因转染**先采用的技术，操作简单，不需昂贵的转染试剂，**今仍有研究者应用此技术。其机制可能是DNA与磷酸钙形成沉淀物，使之粘附到培养的哺乳动物细胞表，被细胞内吞。但此法存在着不足的地方就是转染效率比较低，有些细胞不能用此种方法进行转染。
l．贴壁细胞转染方法
【材料】
(1) 2mol/l氯化钙，0.22μm滤膜过滤除菌，-20℃保存。
(2) 2×HBS缓冲液：280mmol/L NaCI，10mmol/L KCl，1.5 mmol/L Na2HPO4，12mmol/L葡萄糖，50mmol/L HEPES。
将1.6g NaCI，0.074g KCl，0.027g Na2HP04·2H20，0.2g葡萄糖，1g HEPES溶于90ml水中，用0.5mol/L NaOH调节pH为7.0，然后用双蒸水定容**l00ml，0.22μm滤膜过滤除菌，分装，-20℃保存。
(3) 含15％甘油的1×HBS缓冲液。
(4) PBS缓冲液（pH7.4）。
【操作程序】
(1) 在转染前24小时，将对数生长期细胞用胰酶消化，将1×106个细胞接种于60mm的培养皿中，置37℃、5％CO2培养箱中继续培养。
(2) 在转染前2小时，按表13-2配制DNA-磷酸钙共沉淀物
表13-2 DNA-磷酸钙共沉淀物的制备
|
试剂 |
60mm培养皿 |
100mm培养皿 |
试剂 |
60mm培养皿 |
100mm培养皿 |
|
DNA(μg) |
6~12 |
10~20 |
2mol/L氯化钙(μl) |
37 |
62 |
将质粒DNA于0.263ml无菌水中，加入0.37μl 2mol/L氯化钙溶液，混匀后，缓慢加入2×HBS缓冲液，并不断轻轻摇振，缓冲液在30秒内加完。将所配制的混和物在室温静置30分钟。
(3) 弃去细胞培养基，用无血清培养基或PBS缓冲液洗涤一次，将DNA-磷酸钙沉淀物加入培养皿中，在室温下静置20～30分钟，然后再加入5ml培养基，37℃、5％CO2培养箱中继续培养。
(4) 培养24～48小时，可进行瞬时表达检测，或用适当的选择性培养基进行稳定转化克隆的筛选。
2．悬浮培养细胞转染方法
(1) 用离心法收获1×107个细胞，弃细胞培养基，用PBS缓冲液洗涤一次细胞沉淀，再一次离心收获细胞。
(2) 制备DNA-磷酸钙沉淀物，方法同上。
(3) 用0.5ml DNA-磷酸钙沉淀物重悬细胞沉淀，置室温10～20分钟。在细胞悬液中加入5ml完全培养基，置37℃、5%CO2培养箱中继续培养。
(4) 培养16～24小时，收集细胞，弃转染液，换以完全培养液继续培养。
(5) 37℃、5%CO2培养箱中培养48小时后，进行表达检测或者克隆化筛选。
【注意事项】
(1) 在制备DNA-磷酸钙沉淀物的静置过程中，约5分钟出现轻度混浊，浊度越来越深，大约在20～30分钟时，在显微镜下观察出现小颗粒。
(2) 颗粒的大小与转染的效率密切相关，其判定方法是将试管对着光线观察，见溶液呈混浊状态，略带白色，但肉眼又看不见颗粒，在高倍显微镜下则可见均匀细小的颗粒，此时的颗粒为比较理想的状态。如果用肉眼即能看到颗粒，则说明所形成的颗粒太大；如果20分钟后溶液仍然透明，则说明无颗粒形成或形成的颗粒太小。
(3) 在加入2×HBS时，一定要不断的振摇，否则会形成大块状的颗粒。
(4) 在配制2×HBS缓冲液时，一定要注意溶液的pH，其可明显地影响沉淀颗粒的形成。偏酸则不能形成颗粒，偏碱则形成的颗粒太大。这两种情况均可导致转染失败。
(5) 在实际操作中，有的研究者为了增加转染的效率，在转染的(3)步骤后2～4小时进行甘油休克。在实验前需要进行预实验，检测该细胞对甘油的敏感性。方法是：收集对数生长期细胞1×107个，弃培养基，加入0.5ml含15％甘油的1×HBS缓冲液。37℃温育，分别在显微镜下观察1、2、3分钟时的细胞变化，如果在温育过程中，发现细胞变圆并死去，则转染后勿进行甘油休克。如果细胞形态未发生明显变化，才可进行甘油休克。方法同细胞对甘油的敏感性检测。甘油休克后，弃15％甘油的l×HBS缓冲液，用PBS洗一次，加入完全培养基继续培养。
(6) 另个增强转染效率的方法是用氯哇处理细胞。氯喹对细胞具有毒性作用，一般在实验前需进行预实验决定合适的浓度。但对于大多数细胞来说，用浓度为l00μmol/L的氯喹处理或取得良好的效果。可在DNA-磷酸钙沉淀物加入细胞之前或之后进行，但需在甘油休克之前。处理后用PBS液清洗。在处理的过程中细胞会出现泡状变化，这是正常现象。#p#分页标题#e##p#分页标题#e#
方法三：电穿孔转染技术
电穿孔是指在高压电脉冲的作用下使细胞膜上出现微小的孔，导致不同细胞之间的细胞膜发生融合。在后来的研究中发现，对细胞进行电击可以促使细胞通过微孔吸收外界环境中的DNA分子，并进入细胞核内部。
【操作程序】
(1) 在10％胎牛血清DMEM的培养基中生长**50％～80％融合，收集细胞（0.5～1.0）×107/ml，并用冰预冷的电穿孔缓冲液冼涤细胞2次。常用的电击缓冲液有：PBS缓冲液（pH7.4），磷酸盐蔗糖缓冲液（272nmol/L，7mmol/L磷酸钠pH7.4，1mmol/L MgCl2），Hamm’s Fl2培养基（不含小牛血清和抗生素）。
(2) 取0.8ml细胞悬液放人0.4cm的基因脉冲小池（gene pulser cuvette）中，取3～40μg质粒加入细胞悬液中，充分混匀，冰浴10分钟。
(3) 将基因脉冲小池放在电脉冲仪的正负极之间，电击1次，电击条件依据电击缓冲液有所不同（表13-3）。
表13-3 所用的缓冲液及所需的电压
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缓冲液 |
电容(μF) |
电压(V) |
缓冲液 |
电容(μF) |
电压(V) |
|
PBS缓冲液 |
25 |
100~1600 |
Hamm’s F12培养基 |
960 |
250~450 |
(4) 电击后将小池冰浴10分钟。
(5) 从小池中吸出细胞，并用适量的培养墓稀释细胞，37℃、5％CO2培养箱中培养48小时后，进行表达检测或者克隆化筛选。
【注意事项】
(1) 电击的**大电压和电击持续时间是影响转染效率的2个主要因素。电击电压太小和／或持续时间太短，则转染效率太低；如果电击成压太大和／或电击时间太长，细胞将不能存活，所以用此种方法转染为了取得好的转染效率，须进行反复实验摸索出**佳的电击电压和电击持续时间。
(2) 细胞处于有丝分裂期时比较易感染外源DNA，所以在进行转染时，细胞**好处于对数生长期。
(3) 质粒DNA的状态对转染的影响。要使外源DNA整合到细胞染色体上，**好用线性DNA（因为线性DNA有较高的重组几率）。瞬时表达用环状的DNA即可。
(4) 质粒DNA的浓度在2～40μg/ml范围内时，随着DNA的浓度的增加，转染效率随着增加。作为稳定表达时，DNA的浓度为2～10μg/ml，而某些瞬时表达系统则需20～40μg/ml。
基因导入的方法还有DEAE-葡聚糖转染技术、基因显微注射和纳米级分子级颗粒的非脂质体型转染试剂等方法。DEAE-葡聚糖转染的方法一般用于基因瞬时表达，它不易形成稳定转染的细胞系。基因显微注射需要特殊的仪器和设备，操作比较复杂，但这种方法是建立转基因动物模型以研究外源基因在整体动物中表达调控规律的**好方法。同时可以改变动物的基因型，更符合人类的需要，使转基因动物产生人类所需的生物活性物质。纳米级分子级颗粒的非脂质体型转染试剂是一种不含脂类分子、内毒素及任何动物来源的成分，当它与DNA混合时，形成纳米大小的转染复合物，这种技术由于不含脂类分子，所以特别适用于研究脂类分子的实验、信号转导研究及制药公司药物筛选。
筛选细胞克隆：
基因转染人细胞后，有些细胞克隆所转染的基因是高表达，而有些克隆是低表达。有些研究需要对稳定转染的细胞克降进行筛选。一般需要2个过程，一是药物筛选，二是克隆细胞株的转移和扩增。
1．药物筛选 在基因导人过程中只有一小部分细胞获得了外源性的DNA，稳定整合到细胞的基因组DNA中，并且表达产物。为了有效、方便地鉴定出这些细胞来，一般在载体上具有一个能在这些细胞中产生可选择性变化的显性遗传标志。目前常用的这种标志有胸腺核苷激酶基因（tk）、二氢叶酸还原酶基因（dhfr）、氯霉素乙酰转移酶基因（cat）和新霉素磷酸转移酶基因（neo）。表13- 4列出了这些标记所适用的细胞和所用的筛选药物。
表13-4 标记基因所适用的细胞和所用的筛选药物
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标志基因 |
筛选药物 |
所适用的细胞 |
标志基因 |
筛选药物 |
所适用的细胞 |
|
胸腺核苷激酶基因 |
HAT |
tkˉ细胞 |
氯霉素乙酰转移酶基因 |
|
所有真核细胞 |
氯霉素乙酰转移酶基因检测系统不需加入筛选药物，但需在制备的细胞提取物中加入检测试剂乙酰辅酶A和14C标记的氯酶素进行孵育，薄层层析后通过放射自显影测定产物。所以此法常用来分析启动子活性、表达产物的量等，一般用在瞬时表达研究。其他3种用来研究稳定基因表达，**常用的是新霉素磷酸转移酶基因标记系统。下面介绍的是G418筛选的方法。
【操作程序】
(1) 取l00mg G418溶于2ml去离子水中（浓度为50mg/m1），0.22μm微孔滤器过滤除菌，-20'C保存。
(2) 转染后经过48～72小时，待细胞生长接近融合时按1︰4传代。
(3) 继续培养**细胞达50%～70%融合。
(4) 弃去培养液，更换含有800μg/ml的G418培养液进行筛选（其浓度可依据预实验来确定，不同的细胞对G418有不同的适合浓度），与此同时用未转染的细胞作对照进行。
(5) 当大部分细胞死亡时（约3～5天后，在镜下观察，细胞不再贴壁，漂浮起来，细胞变圆） ，再换一次液，G418浓度可降**150～250μg/ml，以维持筛选作用。
(6) 约10～20天后，可见有抗性克隆形成，待其逐渐长大后，将其转移和扩增。
2．克隆细胞株的转移和扩增
将所形成的克隆进行扩增培养的方法常用的有两种方法。
方法一：胰酶–滤纸粘附
【操作程序】
(1) 将所形成的克隆在显微镜下准确标记位置。
(2) 在超净台内，吸去培养基，并用无血清的培养基洗涤两次。
(3) 用无菌镊夹取一块约5mm方形灭菌3MM滤纸，用0.25％胰酶浸湿，置于克隆所标记的位置处，5～20秒。
(4) 将24孔培养板每孔加入含有250μg/ml G418的选择性培养基2ml，用镊子取出粘附有克隆细胞的滤纸块，置于24孔培养基中，涮洗数次，以使滤纸上粘附的细胞脱下。
(5) 将移有克隆细胞的24孔培养板置于37℃、5％CO2培养箱中继续培养。
(6) 待细胞长满后，胰酶消化后，进一步扩大培养。
方法二：胰酶–Tip头吸取
(1) 细胞克隆位置的确定和处理同上(1)和(2)。
(2) 用微量移液29（带无菌Tip头）吸取2～5μg 0.25%胰酶滴在细胞克隆位置上，并反复吹打数次，吸取液体。
(3) 将含有细胞的胰酶液体含有加入250μg/ml G418的选择性培养基2ml 24孔板中。37℃、5％CO2培养箱中继续培养。
(4) 待细胞长满后，胰酶消化后，作进一步扩大培养、鉴定。
上述列出了一些常用的基因导人方法，其结果是否有效地转染，除了用药物抗性筛选标志外，还需对其产物进行检测，进一步鉴定，所用的方法就是应用细胞的分离提取研究，提取RNA进行RT-PCR检测和Northern blot检测，提取蛋白质进行Western blot检测。另外还有下面将要介绍的原位检测。
三、 原位检测研究
对有些很难大量培养细胞的基因和其产物检验和鉴定，很难用提取蛋白质和核酸的方法进行，需要用灵敏度比较高的原位检测的方法。根据检测的对象可以分为两类，一是蛋白质检测，应用原理是抗体与抗原的特异结合，它不但反应蛋白质的表达量，还可以反应蛋白质所处位置；二是核酸检测，应用原理是用标记好的核酸探针与细胞巾的核酸分子进行杂交反应。
1．蛋白质检测 此种方法根据二抗的类型，可以分为化学检测和荧光检测，由于荧光检测的灵敏度比较高，而且也比较方便、简便，所以现较多采用。下面介绍的就是免疫荧光检测。
【操作程序】
(1) 取干净盖玻片，放人75％乙醇浸泡1小时，取出玻片在酒精灯上烤干，用DMEM培养基漂洗数次，放人细胞培养皿中，将传代的细胞传人该皿。
(2) 待盖玻片上长满细胞后，取出玻片用PBS缓冲液洗2～3次，，空气干燥（一定要干燥）。
(3) 将盖玻片浸入-20℃预冷的丙酮内，于-20℃固定30分钟，PBS缓冲液洗3次，空气晾干（必须要于燥）。
(4) 在parofilm膜上滴加**抗体，将盖玻片有细胞的一面向下盖在抗体上，密封于37℃湿盒中孵育30分钟～1小时。
(5) PBS液洗3～6次，空气中晾干。
(6) 加荧光素标记的第二抗体在parafilm膜上，将盖玻片有细胞的一面向下盖在抗体上，放入湿盒中，于37℃孵育30分钟～1小时。
(7) PBS液洗3～6次，空气中晾干。
(8) 用60％的甘油将盖玻片封在载玻上在荧光显微镜下观察。
【注意事项】
(1) 细胞的处理可以在收获后涂片在载玻片上，进行丙酮固定；加抗体于载玻片上，可用盖玻片盖住抗体进行反应。
(2) 所加抗体的量要根据预实验来确定，第二抗体在用时一般需进行稀释，—般以1︰100～1000为宜。
(3) 免疫荧光检测灵敏度高、简便，但有时有较多的非特异性荧光颗粒，所以—定要做阴性对照，可以将**抗体换为其他的无关抗体。
(4) 由于荧光素在自然光下易于褪色，所以实验结果应立即观察，若要保存可将玻片包在黑纸内，置4℃冰箱可保存一周。
(5) 这种荧光检测的方法，有时荧光素标记在**抗体上，则可不用第二抗体，成之为直接免疫荧光检测，此时可以使实验的时间缩短，又可以明显降低非特异反应。上述介绍的是间接荧光免疫检测。
2．核酸检测 这种核酸检测亦称之为细胞核酸原位杂交，其基本原理是利用核酸分子的碱基序列配对的互补性（A：T，A：U，G：C），将已知的有标记的外源核酸分子（探针）与细胞标体内的RNA或DNA进行杂交，经过放射自显影或酶的催化反应显示其在细胞的位置。细胞原位杂交技术近年束发展非常迅速，尤其在发育生物学、遗传学、病毒学及肿瘤学等*域中应用广泛。探针的标记技术和检测技术也不断地更新。由放射性探针到目前许多非放射性探针，如生物素蛋白–AP（碱性磷酸酶）、地高辛–AP和地高辛–HRP（辣根过氧化物酶）等检测系统。根据探针的标记物是否能够直接被检测，原位杂交技术可以分为直接法和间接法两种。为了提高检测技术的敏感度，将PCR技术与原位杂交结合起来，大大提高了检测效率。下面主要介绍培养细胞的原位杂交地高辛–碱性磷酸酶检测技术。#p#分页标题#e##p#分页标题#e#
【操作程序】
(1) 细胞片的制备：
1) 将盖玻片上生长的细胞用PBS液洗涤3次，空气中干燥。亦可取细胞培养瓶中胰酶消化的细胞制成单细胞悬液，涂片到载玻片上；对于悬浮培养的细胞将细胞涂片**载玻片上，此时所用的载玻片要预先涂有多聚赖氨酸。
2) 用1︰1的甲醇：丙酮或4％的多聚甲醛固定10～30分钟。
3) 0.2moL HCl室温作用10分钟，0.1％～0.3％TritonX-100作用15分钟。
4) 含0.2％的甘氨酸的PBS液于室温孵育15分钟。
5) 1μg/ml蛋白酶K（0.1mo/L Tris-Cl，50mmol/L EDTA，pH8.0 配制） 37℃湿盒中消化10～30分钟。
6) 含0.2％甘氨酸的PBS液于室温孵育15分钟。
7) PBS-5mmol/L MgCl2洗2次，每次10分钟。
8) 4％的多聚甲醛固定15分钟。
9) PBS-5mmol/L MgCl2洗2次，每次10分钟。
10) 逐级酒精脱水（70％、80％、90％、95％、100％各5分钟），空气中干燥。
(2) 预杂交和杂交：
1) 将玻片浸入2×SSC中15分钟。
2) 再用50％去离子甲酰胺（4×SSC与甲酰胺等体积配制）37℃孵育15分钟。
3) 加预杂交液20μl/片42℃孵育30分钟～1小时。试剂盒中有此试剂，亦可自行配制，50％去离子甲酰胺，5×SSC，5×Denhardt’s液，2％SDS，100μg/ml变性的鲑鱼精DNA。
4) 去除预杂交液，每片加20μl杂交液（含0.2 ～520μg/ml探针），用硅化过的盖玻片覆盖，石蜡封住盖玻片的四周，42℃湿盒中孵育12～18小时。
5) 去除石蜡，小心移去盖玻片（可以在2×SSC浸泡，让其自行脱落），用2×SSC洗2分钟。
6) 在含20μg/ml RNase的2×SSC溶液中于37℃浸泡30分钟 （此步针对RNA探针，对于DNA探针省略）。
7) 2×SSC 42℃洗涤，10分钟，2次。
8) 0.1×SSC 42℃洗涤2次，每次30分钟，
(3) 杂交检测：
在进行检测前需配制下列缓冲液。缓冲液I：顺丁烯二酸（马来酸）0.1mol/L，NaCl0.15mol/L，用NaOH将pH调**7.5（20 ℃），高压灭菌。
缓冲液Ⅱ：将阻断剂溶于缓冲液I中**终深度为10％（W/V），加热溶解，高压消毒。用水10倍稀释即成缓冲液Ⅱ。
缓冲液Ⅲ（pH9.5，20℃）：Tris-Cl 100mmol/L，NaCl l00mmol/L，MgCl2 50mmol/L。
TE缓冲液：Tris-Cl 100mmol/L，EDTA 1mmol/L。
显色液：取45μl NBT（硝基四氮唑蓝），35μl X-phosphate-solution（5溴-4氯-3吲哚磷酸，BCIP），加10ml缓冲液Ⅲ混和而成（现配现用）。
【操作程序】
1) 将玻片用缓冲液I洗涤，室温，2分钟。
2) 将玻片用缓冲液Ⅱ洗涤，室温，30分钟，不断振摇。
3) 用缓冲液Ⅱ将地高辛抗体–碱性磷酸酶1︰5000稀释，将玻片浸入此溶液中1～2小时。
4) 缓冲液I洗涤，室温，15分钟，2次。
5) 缓冲液Ⅲ洗涤，室温，3分钟。
6) 将玻片浸入显色液中，室温，避光显色，16小时（在显色过程中，不要晃动液体）。
7) TE缓冲液洗涤，室温，2分钟。
8) 用亲水性封片剂封片，显微镜下观察。阳性反应呈深蓝色。
综上所述，本节详细描述了细胞培养过程小的分子生物学研究操作步骤。如前所述，任何基因的功能，都需要通过细胞内的过程加以研究和检测，因而细胞培养技术是分子生物学的不可缺少的一个重要部分。
第二节 细胞培养在生物工程中的应用
生物工程是指用生物体或其组成成分自**适条件下生产有益产物或进行有效过程的技术它所包含的内容有主要有基因工程、酶工程、发酵工程、细胞工程、生化工程等。近年来把细胞的大量培养亦列为细胞工程的内容。在这些内容中与动物细胞培养相关的主要是细胞工程。
细胞工程是生物工程的一个重要方面。总的来说，它是应用细胞生物学和分子生物学的理论和方法，按照人们的设计蓝图，进行在细胞水平上的遗传操作及进行大规模的细胞和组织培养。当前细胞工程所涉及的主要技术*域有细胞培养、细胞融合、细胞拆合、染色体操作及基因转移等方面。通过细胞工程可以生产有用的生物产品或培养有价值的细胞株，并可以产生新的物种或品系。
细胞工程已经渗透到人类生活的许多*域，取得了许多具有开发性的研究成果，有的已在生产中推广，收到了明显的经济和社会效益。随细胞工程技术研究的不断深入，它的前景和产生的影响将会日益地显示出来。
根据设计要求，按照需要改造遗传物质的不同操作层次，可将细胞工程学分为染色体工程、染色体组工程、细胞质工程和细胞融合工程等几个方面。
1．染色体工程 染色体工程是按人们需要来添加、削减或者替换同源或异源染色体或其中的某一部分的方法技术。可分为动物染色体工程和植物染色体工程两种。动物染色体工程主要采用对细胞进行微操作的方法（如微细胞转移方法等），来达到转移基因的目的。植物细胞工程目前主要是利用传统的杂交回交等方法来达到添加、消除或置换染色体的目的。
2．染色体组工程 染色体组工程是按照人们的设计，削减或添加同种或异种染色体组，以改变生物遗传物质的技术和方法。经过这种遗传物质改造的物种，会符合人们的需要，如四倍体水稻的稻粒比二倍体的明显大，蛋白质的含量可提高5％～50％。但这项技术一般应用在植物上。#p#分页标题#e##p#分页标题#e#
3．细胞质工程 又称细胞拆台工程，按照人们的没想，运用物理或化学方法将细胞质与细胞核（或细胞器，如线粒体）分开，再进行不同细胞间核质的重新组合，重建成新细胞。可用于研究细胞核与细胞质关系的基础研究和育种工作。克隆羊“多莉”就是一个很好的例子，此项技术又称核移植技术。
4．细胞融合工程 是用自然或人工的方法使两个或几个不同细胞融合为一个细胞的过程。可用于产生新的物种或品系（植物上用得多，动物上用得少）及产生单克隆抗体等。其中单克隆抗体技术，利用克隆化的杂交瘤细胞分泌高度纯一的单克隆抗体，具有很高的实用价值，在诊断和治疗病症方面有着广泛的应用前途（此项内容在细胞培养生物制品的应用中有介绍）。另外细胞融合也应用在基因功能和寻找致病基因的研究中，如小鼠骨髓瘤细胞与人淋巴细胞融合后的杂种细胞总是保留着小鼠完整染色体组型，而仅有一条**数条人染色体。根据染色体分析技术对杂种细胞及亲本瘤细胞生物功能（如酶谱等）分析，说明是由于人染色体整合到瘤细胞染色体中所引起的。同时细胞融合技术也可用于分析癌基因在染色体中所处的位置，目前已知肿瘤基因可诱发肿瘤，采用细胞融合及染色体分子技术测定细胞致癌染色体，即可判断致癌基因在染色体上所处位置。因此，细胞融合技术对研究染色体结构，阐明生物变异及肿瘤发生与发展机制有一定指导意义。
细胞培养除了在细胞工程应用**多之外，在酶工程中亦有应用，即将细胞限制在特定的空间位置，与酶同样起到生物催化剂的作用。此项技术称之为固定化细胞技术。这种技术由细菌已经扩展到动物细胞，甚**到细胞器，如线粒体、微粒体等。
大规模的细胞培养技术是细胞工程的一个内容，指在人工条件下，搞密度大量培养有用动物细胞，生产有应用价值的细胞产品的技术，如疫苗（口蹄疫苗、狂犬病毒疫苗、脊髓灰质炎疫苗、牛白血病病毒疫苗、乙型肝炎病毒疫苗、疱疹病寿I型及Ⅱ型疫苗、巨细胞病毒疫苗等）、蛋白质因子（凝血因子Ⅷ和Ⅸ、促红细胞生成素、生长激素、IL-2、神经生长因子等）、免疫调节剂（α、β、γ干扰素）及单克隆抗体等；也是生物工业中大量增殖新型有用细胞不可缺少的技术，一些培养细胞可用于治疗，如刘书钦等建立和应用大规模培养系统，诱导获得了移植人的CTL（细胞毒性T淋巴细胞），具有抗人肺鳞状癌肿SQ-5能力，保存3个月以后仍保持很高杀伤活性，达95％以上。在本节中主要介绍细胞的大规模培养。
当人们认识到利用细胞培养可以产生激素、疫苗、单克隆抗体时，而且对它们的需要量急剧增加，细胞的大规模培养应运而生了。开始是单靠增加容器的体积和数量来解决细胞产量的问题，随着对动物细胞反应动力学的认识和培养技术的改进，使得动物细胞工业化培养成为现实并逐渐成熟，目前在生产规模上已经达到10 000L。
一、大规模细胞培养的体系参数
动物细胞的大量培养与小规模培养（培养容量小于2L）相比，条件更严格，控制难度更大，但培养的条件有些与小量培养是一致的。常用的参数有：选用的培养基是无血清培养基，对于悬浮培养的细胞，为使其细胞不致凝集、成团或沉淀，在配制培养基的基础盐溶液中不加Ca2+和Mg2+。加入一些非营养性的培养液补充物，如0.11％的羟甲基纤维钠，它可以减轻在培养过程中由于机器的搅拌造成对细胞的剪切损伤。0.11％的pluronic F–68，它可以减少在通气和搅拌过程中所产生的气泡。一些特殊的细胞需加入一些营养因子，如转铁蛋白、胰岛素、亚硒酸盐等。细胞培养温度足37℃，在细胞接种前培养液需预温**37℃。细胞的接种密度为（5～20）×104个/ml。搅拌速率依据培养容器和细胞的培养方式决定，一般对悬浮细胞可用100～500rpm，而微载体系统20～100rpm。pH一般控制在7.4，但有些细胞偏好在7.0，如杂交瘤，但不能低于6.8，否则将抑制细胞的生长。pH的稳定维持一般是依靠CO2-NaHCO3系统，采用通入5％CO2无菌空气的方式。260～320mOsm/kg的渗透压对大多数细胞来说是适宜的。在培养过程需补充足够的氧气（一般是通无菌空气），氧气供给是细胞大规模培养的一个限制因素。氧化还原电位适用于大多数细胞的值是+75～l00mv左右。在培养过程中，还要补充一些成分，如转铁蛋白、胰岛素、谷氨酰胺等。
二、大规模细胞培养的工艺类型
无论呈悬浮生长的细胞还是贴壁生长的细胞，按操作方式，将工艺类型可以分为以下四种：
1．分批式培养 星指将细胞和培养物一次性加入培养反应器内，在细胞生长和产物生成同时进行，经过一段刚司反应后，将整个反应体系取出。这种培养方式，细胞生长的环境处在不断变化之中，如营养物质不断减少，乳酸等代谢抑制物增加，不能使细胞处在一个**优化的条件下，因此在应用过程中受到一定的限制。
2．流加式培养 针对分批式培养的缺点，在反应过程中不断加入新鲜的培养液，使细胞继续生长繁殖和生成产物，直到反应结束后取出反应体系。它可以避免细胞在代谢过程中的产物以及某些营养物质的缺乏对细胞的抑制作用。#p#分页标题#e##p#分页标题#e#
3．半连续式培养 也称反复分批式培养，是指在分批式培养过程中，不断取出培养物，每次补充以新的培养液，再进行分批式操作。它与流加式培养的区别是，流加式培养的体积是不断增加，而半连续培养的体积是保持不变的。
4．连续式培养 是指将细胞和培养液一起加入反应器后，采用灌注培养法，连续排出用过的培养基，与此同时连续地加入新鲜的培养液，一般不输出细胞，使细胞在一个恒定、优化的环境下生长和生成产物，但细胞在数量有波动。如果同时取出与培养液等量的细胞则称为连续–流动式培养，它是在真正内环境上保持稳定，营养物质、代谢产物和细胞数量不存在波动。这种方法适用于悬浮细胞和在微载体上生长的细胞。
在这些工艺中，以连续培养为**佳类型，因为系统优化的环境符合细胞的生理和代谢规律，有利于细胞的生长、增殖和生成产物，但也有些缺点，如培养基的消耗量大，操作过程复杂，增加了污染机会等。
三、 大规模细胞培养方法
培养方法比较多，大致可以分为悬浮培养、固定化培养和微载体培养法。
1．细胞悬浮培养法 细胞在培养液中呈悬浮状态生长繁殖的培养方法称之为悬浮培养法。适用于培养细胞株、肿瘤细胞、血液细胞及淋巴组织细胞，用于大量生产疫苗、α–干扰素、白介素及McAb（单克隆抗体）等药品。但此法不适用于少数转化细胞和人二倍体细胞（WI-38、MRC-5），这些细胞在这种条件下培养则完全不能生存。一些原本贴壁生长但具有悬浮培养潜能的细胞在体外经诱导和选择后，可以应用此种体系进行培养，如由L929细胞诱导出的LS细胞系，由HeLa细胞诱导出的HeLa-S3细胞等。
此种体系明显的优点是培养的体积大、成本低，可连续收集部分细胞进行移植传代培养，传代时无需消化分散，免遭酶类、EDTA及机械损害。细胞处于均匀一致的培养基中，因此可以获得稳定状态，并且容易放大。细胞回收率高，并可连续测定细胞浓度，还有可能实现大规模直接克隆培养。
为了确保细胞在培养过程中呈单颗粒、均匀悬浮状态，在培养系统中使不同的培养相之间（生物学的、液体的、气体的）保持合适的物质转移率，以及便利散发系统产生的热量，需采用通气搅拌或空气提升式（常简称气升式）生物反应器。
通气搅拌生物反应器，其装置中的搅拌器（图13-l所示）具有笼式的通气腔和消泡腔。气液交换在由200目（75μm）不锈钢丝网制成的通气腔内进行，在通气过程中所产生的气泡经管
道进入液面上部的消泡腔内，气泡碰到钢丝网，破裂分为气体和液体两部分，从而达到了深部通气和避免产生气泡的目的。
气升式生物反应器（图13-2），是依据气泡柱的原理设计的，气体混和物从底部的喷射管进入反应器，产生的气泡进人中央引流管，此时管内的培养液的密度将小于外周的培养液，推动着中央管中的培养液上升，从中央管流出的培养液向下循环到容器的外侧，从而形成一个循环，这样产生混匀作用（气泡代替机械搅拌细胞），与此同时进行供氧。这种反应器有2种类型，内循环式和外循环式，一般采用的是内循环式，也有采用外循环式。目前10 000L的气升式反应器已经设汁成功并投入使用。图13-3所示是1000L动物细胞气升式培养流程图。体外悬浮液细胞密度一般在5×106个/ml以下，要提高细胞产量，需扩大细胞培养规模，规模越大则越难控制。
2．固定化培养法 将细胞限制或定位于特定空间位置的培养技术称之为细胞固定化培养法。动物细胞几乎皆可采用固定化方法培养。固定化方法有吸附法和包埋法。
吸附法是**简单的固定化培养方法。细胞在适当的条件下能够贴附在载体（如陶瓷颗粒、玻璃珠及硅胶颗粒）的表面，或附着于中空纤维膜及培养容器表面。由于其负载能力不高，有时细胞会从载体表面脱落，不能达到保护细 胞的目的，同时细胞的扩散没有限制。
包埋法是将细胞包埋于多聚物（蛋白质、碳氢化合物）等海绵状基质中的进行培养方法。蛋白质多聚物有明胶、胶原和纤维蛋白质。明胶在30℃以上即融化，而细胞的**适生长温度是37℃，所以不能作为动物细胞包埋的介质。可溶性纤维蛋白原通过凝血作用后，生成不可溶性纤维蛋白，但机械稳定性差。但如果这种转化作用在两相系统中完成，则机械强度增加，形成球形，此多聚物适合用于包埋贴壁依赖性生长的细胞。碳氢化合物的多聚物可以用于包埋细胞的有海藻酸钠和琼脂糖。海藻酸钠与细胞混和后，当加入一定浓度的氯化钙时，能形成凝聚的小球，即不溶的海藻酸钙，细胞即包埋在小球内。这种方法可以用于包埋血细胞。**后用柠檬酸钠或离心破碎聚合物，收获细胞和产物。许多琼脂糖都适用于动物细胞的固定化，它需借助于石蜡油的作用形成小球体（80～ 200μm）。这种包埋方法**适合于悬浮细胞，被广泛用于培养杂交瘤细胞产生单克隆抗体。#p#分页标题#e##p#分页标题#e#
固定化培养优点在于，细胞可维持在较小体积培养液中生长，可以获得较高的生长密度（（50～200）×106个细胞/m1），细胞损伤程度低、培养的寿命长，易于更换培养液，细胞和培养液易于分离，培养液中产物浓度高，简化了产品分离纯化操作。
这种方法所采用的生物反应器有螺旋卷膜培养器、多层托盘式培养器、中空纤维及流化床式培养器等（图13-4）。后两者具有工程化配套设备，已经进入工业化生产。
中空纤维培养器属填充床式反应器，反应器内的中空纤维，为细胞以组织样生长提供了复杂的脉管系统，当细胞灌人培养系统时，纤维壁为细胞贴壁和生长提供了巨大的表面积。这种反应恭不但可以适用于悬浮生长的细胞，又可以培养贴壁依赖生长细胞，细胞生长密度可高达108个/ml以上，如果控制得当，不受污染，细胞培养可达数月，易于实现连续培养。
流化床培养器是使支持细胞生长的微粒呈流态化，微粒的大小约为500μm，而且具有多孔性。细胞接种于微粒中，反应器的垂直向上的循环流动使培养液成为流化床，在此过程中不断地供给细胞营养成分和氧。培养液虽处流动状态，但对细胞不会造成剪切机械损伤。所以它具有培养的细胞密度高，可以长期、连续培养等优点。
3．微载体培养方法 将细胞吸附于微载体表面，在培养液中进行悬浮培养，使细胞在微载体表面长成单层的培养方法，称为微载体培养法或微珠培养法。
动物细胞贴附在微载体表面生长与细胞表面及微载体表面的化学–物理性质有关，微载体表面带有正电荷，而细胞表面带有负电荷，这种静电吸引作用使细胞易于在微载体表面贴附，一些细胞分泌纤粘素和冷析球蛋白（两者都是糖蛋白），起到细胞与载体表面的架桥作用，而溶液中的钙、镁离子等二价离子作为糖蛋白结合的媒介。
用于制备微载体的材料的理想条件是对细胞无毒，具有一定的亲水性，易于贴附细胞，其密度要略大于培养液，在1.03～1.05之间，但不能大于1.1，能够高压灭菌、重复利用，载体的直径在40～120μm范围内等。
目前已被选用的材料有交联萄聚糖、DEAE-纤维、塑料基质、玻璃介质等，如表13-5列出常用的类型和特征。
表13-5 常用的微载体类型
|
基质材料 |
类型 |
直径大小（μm） |
形状 |
表面积 |
|
交联葡聚糖 |
Cytodexl1 |
131~220 |
球形 |
6000 |
上述微载体中，为了更好地吸附细胞，特别是一些体外培养贴壁比较困难的细胞，为了解决这个问题，Cytoder3是在交联葡聚糖的表面上化学耦合了一层变性胶原。有的载体具有高正电荷的毒性效应，为了降低此种反应，可用火棉胶涂抹载体表面。目前研究者正在不断地研制和开发新的载体，以满足日益增加的大规模细胞培养和细胞制品的需要。
微载体培养这种模式兼有单层细胞培养和悬浮细胞培养的特点。它依靠的是微载体的表面积/体积比较大的特点，增加细胞生长的表面积，例如Cytodex 1干颗粒直径为60～87μm，在培养液中可膨胀成160～230μm，每克微粒表面积约为0.6m2，相当于7个标准转瓶（Φ285×110mm）或6块多层托盘用的玻璃培养板表面积，细胞生长密度可达105个/ml。通过增加培养罐体积即可达到扩大培养规模的目的，而且培养基的利用率高，细胞较容易收获，所占空间小，减少厂房及设备投资，节约动力消耗及人力，又便于对反应系统进行检测与控制。由于以上优点，贴壁依赖生长的细胞大多采取这种方式。
常用于微载体培养系统的生物反应器是CelliGen罐，它是一种笼式通气搅拌生物反应器。#p#分页标题#e##p#分页标题#e#
第三节 细胞培养在生物制品中的应用
一、生物制品的概念
目前认为凡是从微生物、原虫、动物或人体材料制备或用现代生物技术、化学方法制成，作为预防、治疗、诊断特定传染病或其他疾病的制剂，通称为生物制品。狭义的生物制品包括菌苗、疫苗、类毒素、抗毒素和抗血清等。广义的生物制品还包含抗生素、血液制剂、肿瘤以及免疫病等非传染性疾病的制剂等。所采用的现代生物学技术，一般认为主要包括基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程四个部分组成，但还有一些边缘技术。其中细胞工程包括细胞培养和移植、细胞融合、动物的胚胎工程、植物的微繁殖、单倍体育种、原生质的培养和细胞杂交等。可见在生物制品学中，细胞培养是生物制品的一个主要的应用技术。通过细胞培养所能获得的生物制品主要有：单克隆抗体、病毒疫苗（狂犬病、乙型肝炎等）、生长因子（表皮生长因子、神经生长因子）、免疫调节剂（干扰素）、酶（组织血纤溶酶原激活剂）、细胞克隆等。本节主要介绍细胞培养在疫苗制备中的应用。
二、细胞培养在疫苗制备中的应用
生物制品中一大类就是疫苗，它包括细曲性疫苗、病毒性疫苗。其中病毒性疫苗的发展可分为三个时期。**，古典疫苗时期，在原体发现以前，根据反复观察和摸索经验而制出疫苗时期，古典疫苗只有牛痘苗和狂犬病疫苗，所采用的方法是以动物制备或动物培养技术。第二，病毒培养疫苗时期，即利用病毒培养技术制备疫苗时期，所制出的疫苗称为传统疫苗。此时所采用的技术是小鼠、鸡胚和细胞培养技术，产生的疫苗有黄热病、流感、乙型脑炎、脊髓灰质炎、麻疹等疫苗。第三，基因工程疫苗时期，即依照生物工程技术研制而出的病毒亚单位疫苗时期．研制出来的这类新型疫苗就是基因工程疫苗，它采用了分子生物学、分子免疫学等新技术，如乙型肝炎病毒疫苗。可以这样认为，动物疫苗、鸡胚疫苗、细胞培养疫苗，是多种疫苗发展的三步曲，如狂犬病疫苗经历过动物疫苗、鸡胚疫苗，**后发展为细胞培养疫苗。为比较动物、鸡胚、细胞培养、基因工程疫苗的发展，将各种技术所制备的主要疫苗种类列入表13-6。
基因工程疫苗是现在疫苗的发展趋势，但有些疫苗仍不能通过这种方法进行疫苗的制备。细胞培养是一项比较可行、简单制备疫苗的策略。同时细胞培养也是病毒研究工作中**主要的基础之一。细胞培养使生物制品学有很大的发展，可以获得纯系病毒，给活疫苗选毒种提供了**佳条件。制备各种死活疫苗，尤其加工制备浓缩提纯疫苗，大大提高了效力，减少了反应，取代了许多用动物或鸡胚制备疫苗。近年发展起来的悬浮细胞培养、微载体细胞培养和中空纤维培养，已经走上了大批量、工业化、自动化培养技术。
表13-6 各种技术所制备的主要疫苗
|
疫苗种类 |
主要疫苗 |
制备方法 |
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动物疫苗 |
疫苗(牛、羊淋巴液) |
鸡胚、细胞培养 |
在疫苗制备上，细胞培养相对于动物培养、鸡胚培养仍有许多得天独厚的优点。
1．细胞没有特异性的免疫力。细胞在离体组织培养后，不存在免疫作用，易被病毒感染。
2．病毒敏感范围广泛，有些病毒具有严格的宿主及组织特异性，但离体的细胞培养，对病毒的敏感范围就比较广泛。如脊髓灰质炎病毒可以在非神经细胞上生长，对原始人羊膜细胞不敏感，但在原代培养的羊膜细胞则敏感，并有细胞病变。肠道病毒、呼吸道鼻病毒等大都能在猴肾细胞培养上生长。
3．在分离病毒时，细胞培养可大量接种标本，从而增加了分离几率。
4．提高了收获物的纯度，易于加工处理。
5．细胞培养瓶间的差异比较小，大大地提高厂实验的准确性、重复性。
目前常用的细胞培养的细胞类型及所制备的疫苗类型如表13-7所示。
#p#分页标题#e##p#分页标题#e#表13-7 细胞培养制备疫苗所用的细胞类型和疫苗类型
|
细胞类型 |
疫苗 |
|
人成纤维细胞 |
HAV(甲型肝炎病毒) |
下面以狂犬病疫苗的制备为例简单介绍苗的制备过程。
1．使用12g左右健康的金黄地鼠，无菌取肾，去除肾包膜、结缔组织及血凝块。
2．将肾皮质切成1mm3大小的组织碎块，丢弃髓质部分。
3．用0.25％的胰酶消化组块30分钟。
4．离心收集细胞，并制成单细胞悬液。
5．按常规培养，制成单层细胞。
6．接种病毒，用10L转瓶继续培养，分两阶段进行，37℃培养3天，于第4天收集病毒溶液；更换培养液，33℃继续培养，3天后，收集病毒培养液。
7．进行病毒毒力滴定试验，要求达到5LogLD50/ml。
8．经过0.45μm滤膜滤过，用分子量30万超滤膜进行超滤浓缩，浓缩后用1︰1000 ~ 1︰10 000的9-丙内酯灭恬，灭活后的浓缩液经过凝胶过滤柱层析及离子交换柱层析进行两步纯化试验。
第四节 细胞培养在药物开发中的应用
人类的进步可以说是与疾病不断斗争的过程，而药物是用于顶防、诊断和治疗疾病和按需要有效调节人体生理功能的重要物质，是人类防病治病、提高人体健康水平的有力武器。所以科学家们利用各种技术研制开发治疗疾病的药品。尤其是现在，在药物开发上有了很大进步，如以基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程为主体的现代生物技术和组合化学技术，已经成了药物开发的一个技术支柱。正是由于这些技术的进步，并应用这些技术改造传统的制药工业，使得开发出的药物具有高效、低副作用等优点。
一个药物的开发，包括以下几个过程：疾病流行趋势、市场需求、技术水平现状等基本情况调查；开发项目立题论证，视制药公司的人力、财力、设备等综合实力而确定立项研究；开展包括筛选、合成、提取、发酵等创新药物的研究；创新药物理化性质及其化学结构的研究，动物筛选试验，发现候选化合物；开展包括药效药理、一般药理、一般毒性、特殊毒性、代谢、工艺与制剂研究等的新药临床前试验研究；开展包括I、Ⅱ、Ⅲ期试用的新药临床试验；申请承认许可，新药上市。调查结果表明，在20世纪90年代，一个新药开发成功，需15年，临床前期试验需要6.5年，I、Ⅱ、Ⅲ期临床分别需要1.5年、2年、3.5年，美G食品与药品管理局（FDA）审批需1.5年。一般有这样的规律，在每5000 ~ 10 000个进入临床前期试验的化合物中，只有5个进入临床试验，到**后只有1个获得批准上市，整个过程成奉需要花费5亿美元。由此可以看出，一个新药的开发，是一个风险大、周期长、高投入的过程。
在当今世界，科技发展迅猛，在不断探索新工艺、新方法、新设备来解决开发药物中的周期长、成本高的问题。由于有大量的化合物进入临床前期的药理学、毒理学、药效学等研究和筛选。在这个筛选过程中，根据所选用的材料和药物的作用对象以及操作特点，可将筛查模型分为三种：整体动物水平、组织器官水平、细胞分子水平。目前得到广泛应用的就是细胞分子水平的药物筛选模型。它与整体水平、器官组织水平的模型相比，细胞系的生物学特征较为一致，可用于观察药物对细胞形态及生理特征的影响，从而判断药物疗效及其毒性，具有材料用量少、药物作用机制比较明确、可以实现大规模筛选、缩短新药筛选周期等特点。细胞分子水平药物筛选模型的应用为自动化操作奠定了基础，使药物筛选由传统手工筛选形式转变为由计算机控制的自动化大规模筛选的新技术体系，形成了高通量药物筛选（high throughut screening，HTS）。采用细胞分子水平筛选模型进行药物筛选，在两方面表现出极大的优势为，一是大样本量的筛选，由于药物筛选是对未知的探索和发现的过程，只有扩大筛选对象和范围，才能找到高质量的药物。二足实现了一药多筛，由于这类药物筛选模型所需样品很少，可以使珍贵的药物在多个模型进行筛选，不但扩大了新药的范围，而且有助于从老药中发现新的用途。据报道，20世纪90年代初期，一个实验室采用传统的方法，借助20余种药物作用靶位，一年内仅能筛选75 000个样品；到了1997年HTS发展的初期，采用100余种靶位，每年可筛选1 000 000个样品；而到1999年，由于HTS的进一步完善，每天的筛选量就高达100 000种化合物，因而，称之为超高通量筛选（ultrahieh-throughput screening）。这种新的飞跃，将大大加速新药发现的速度。#p#分页标题#e##p#分页标题#e#
组织细胞培养技术的进步为高通量药物筛选奠定了技术基础。这是组织细胞培养技术在药物开发应用中的一层含义，另一层含义是利用细胞培养制出新的药品，这一部分主要是指利用基因工程和细胞工程获得（在前面有介绍）。在本节中主要介绍细胞培养技术在药物筛选测试中的应用。
培养的细胞可以用于药物高通量筛选，但亦一些不足：①由于在体内存在着许多因素可能对药物进行修饰，导致药物作用的增强或减弱，由无致癌性转变具有致癌性，所以在细胞培养条件所得的结果可能不一定就适用于体内。②药物对细胞的作用可以有多种表现，但由于检测手段和检测方法的限制，可供药物筛选的指标有限，所以在进行测试时应尽量取多种细胞类型，扩大检测范围。
药物测试的基本程序如下：
1．细胞选择 利用细胞培养技术进行药物测试时，shou先根据目的选择合适的细胞类型，如果选择的细胞不合适，则影响实验结果的可信性和参考价值。目前用于药物开发测试研究的培养细胞主要来源于原代细胞、细胞系和细胞株，这三种细胞培养的特点见表13-8。
表13-8 三种培养细胞的某些特征
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|
原代细胞 |
细胞系 |
细胞株 |
|
培养生存时间 |
数小时–数天 |
数月–无限期 |
常为无限期 |
从表中可以看出，这三种细胞有各自的优缺点，在应用时要根据具体情况进行选择。
如果在药物效应不明的情况下，对实验组细胞的选择可不必十分严格，但为了解药物可能的作用，**好多选用几种类型的细胞进行。如已知药物有特殊效应的或欲求获得对某一类细胞产生作用时，应尽量采用相应的细胞。如果是神经系统药物则用神经细胞，抗癌药物用癌细胞，如HeLa、KB、HL–60（人急性早幼粒白血病）、U937（人单核细胞白血病）、A-549（人肺腺癌）等，这样获得的结果才有参考价值。
对照细胞是实验组合中不可少的组成部分。原则上实验细胞和对照细胞越相似越好。如检测某一药物用的是正常细胞，对照细胞可用同一细胞但不用药物处理或仅用溶媒液处理即可。
2．药物的溶解和保存 药物在具体使用前一般都需配成贮存液，要根据药物的性质选择适当的溶剂，如果是水溶性，即可用不完全培养基或者PBS液配制100×母液，用时按所需浓度进行稀释。有些药物不适宜水溶液配制的，可以用DMSO（二甲基亚砜）或无水乙醇进行配制，要求要药物工作浓度下，DMSO和乙醇的浓度要小于0.2％（V/V），这时不会对细胞产生毒性，进行实验时，对照组要加入同等量的溶剂。所配制的母液根据药物的性质进行保存，一般在-20℃．但有的药物需放置于-70℃比较稳定，一些光敏药物还需避光保存。
3．药物活化 运用培养细胞进行药物检测有时并不能反应体内情况，确些药物经过肝脏后，会发生生物转化作用，如可能会使得原来没有细胞毒性的药物会产生毒性。为了弥补此缺陷，设计了一个与体内环境比较相似的药物活化试验，运用大鼠或人的肝细胞恬检材料和S9混和液在体外将药物活化。受试药物和S9混和液与细胞接触作用时间一般为6小时。
4．药物剂量 在试验开始前，需先确定待测药物适用剂量。与利用动物做试验一样，先宜测出半效应量（median infective dose，LD50）。它的计算方法有两种方法，一种是粗略估计法，另外是借用药物的LD50（半致死量）进行精确计算。如果被测药物是抗癌药物或者是三致物（致畸、致突变、致癌）则两者可等同。
粗略估计法：根据药物的作用选择合适的指标进行药物的有效反应性。例如检测抗癌药物杀细胞活性，如果其已在临床应用或做过动物试验，此时可按已用药量推算。在无据可依的情况下，只有按试验者经验确定一组梯度数值，如11μg/ml、3μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml然后安排一组培养细胞，共2瓶/组×5。分别向五组培养细胞中加入五个剂量的药物，作用一定时间后，用台盼蓝染色法测试死活比数（存活的细胞可以排斥许多染料，如台盼蓝，细胞不着色，而死亡的细胞和严重受损细胞由于细胞膜的通透性改变，染料可通过细胞膜而被着色）。将所得数值进行直线回归，取50％死亡细胞时的浓度做为粗ID#p#分页标题#e##p#分页标题#e#50。亦可用MTT的方法，设立一个对照组，不加入药物，以此为100％的存活，取OD570的值下降到50％的药物浓度。这种方法在96板上即可完成，方便、简单，比较准确。比较适用于贴壁细胞，如果足悬浮细胞，在操作过程中需要用到96孔板离心机。
借用计算LD50一些常见的方法有：寇氏法（Karber’s method）、改良寇氏法和何尔恩法（Horn’s method）等，这些方法比较准确。在计算过程有些复杂的运算，为了解决这个问题，一些研究机构开发出计算机软件，使得计算更准确和快速，如Bliss法。下面的计算公式是改良寇氏法：
LogID50＝Xm－i （∑P－0.5）
i＝Log （**大剂量／相邻剂量）
∑P＝各组阳性反应率之和
此法比较简单，准确性也较高，但要求**大阳性反应组的阳性率>80％，而且**小反应阳性率不小于20％，否则要换用其他方法。
待ID50确切值获得后，取ID50/10作为主要测试剂量。
5．药物作用时间 确定出待测药物的ID50后，取ID50/10为试验剂量。根据细胞的生长特性进行加药。如原代培养的细胞或收获的贴壁细胞（经胰酶消化过）一般要等到**少12小时以后，此时细胞对药物的敏感性恢复到非胰酶水平。一般的**适宜时间是在接种后约第48小时，此时细胞已进入指数生长期，加药后可再更换一次培养液，然后加入测试药，置温箱中培养。药物在瓶皿中于细胞接触时间要依据药物的性质（如半衰期）和细胞的敏感性决定，在试验开始时，需进行预实验，做出药物的作用效应和时间关系的曲线，依此进行选择适当的作用时间。一般不应少于8小时，也可处理12～24小时或更长些，然后弃掉含有药物的营养液，用不完全培养液洗1～2次，再补充新的培养液继续培养。
6．细胞的观察 在试验开始后，每天或按一定时间间隔，取出1组培养细胞进行观察，从瓶皿中抽出盖玻片做各种方法的染色观察，瓶皿中余下细胞制成细胞悬液通过计数等手段检测细胞数量。总之为检测药物对细胞生物效应，可结合应用各种技术方法，进行有针对性的检测。
通过一些观测指标对细胞进行观察，才能了解药物对细胞的效应如何。各种药物对细胞的生物效应各不相同，必须选择相应的指标。下面列出了一些常用的检测指标。
(1) 细胞形态（光镜下）：杀伤性药物作用细胞后，可能有多方面反应，一是细胞的形态和生长变化，在显微镜下容易判定，因此这项检测可作为与台盼蓝检查细胞同时并举的指标。有些细胞的形态是生长的一个特征，如神经细胞在体外生长，可以明显地观察到长长的轴突，当用杀伤性药物作用时，它的轴突会缩短。另一种是对细胞代谢和基因表达的变化。根据形态变化和生长速率变化的结果，可大致分为以下5个等级：
0度：细胞在一定剂量一定时间药物作用下，无任何反应，细胞形态正常，生长能力无改变，贴壁细胞紧贴瓶底，无脱落，细胞的折光性好，以（－）表示。
1度：细胞生长速度减慢，细胞分裂指数下降，细胞轮廓增强，有少量贴壁细胞开始脱落，胞质中出现颗粒，以（+）表示。
2度：细胞生长非常缓慢，细胞分裂指数显著下降或近于消失，细胞轮廓增强，胞质粗糙，部分细胞脱离瓶底，胞内有颗粒堆积，以（++）表示。
3度：细胞生长完全停止，分裂象消失，细胞回缩，相互间隙加大，细胞轮廓非常明显，大部分细胞脱落，胞质极度粗糙，内充满颗粒堆积，以（+++）表示。
4度：细胞全部脱落死亡，残余的细胞亦濒死或崩溃溶解，培养基的颜色显示为碱性，以（++++）表示。
(2) 化学成分检测：有的药物对细胞功能的作用常表现在对某种物质代谢产生抑制作用（如胶原），则以测试该成分在细胞内或培养液中的含量，即可感知药物的效应。对酶有作用时，可用组织化学方法或电泳等方法检测。TorranceCJ等利用现代分子生物学技术，开创了一类针对产物检测的新的策略，它的检测速度快、自接，而且在缺少对照细胞的情况下也可进行。作者将一具有K-ras基同突变的结肠癌细胞系DLD-1，通过同源重组的方法将其转变为无K-ras突变的细胞系．将DLD-l转染一种黄色荧光蛋白，而将缺失K–ras突变的细胞系转染有蓝色荧光蛋白，二细胞系在不加任何抑制物共同培养时则生长速度相同。研究者用此体系去筛选药物，在药物的作用下，如果黄色荧光增强，说明药物抑制了缺失K-ras突变的细胞的生长，如果蓝色荧光增强，则说明药物抑制了含K-ras突变的细胞的生长。运用这种方法，一共筛选了30 000个化合物，发现一个胞苷类似物在体外具有抑制含K-ras突变的细胞的生长。
(3) 超微结构的变化：细胞受药物作用后，形态上很容易发生改变，如成纤维细胞突起回缩，上皮细胞相互分离变成梭形等，在一般光学显微镜下很容易看到，但这些变化十分不可靠，应主要以超微结构观察到的改变为依据，如对细胞膜、微绒毛、内质网、线粒体、细胞核等微细结构的影响。
(4) 细胞死亡检测：致死效应是药物检测中，特别是抗肿瘤药的重要指标。细胞死亡是一个很复杂的生命过程，shou先应明确细胞死亡的概念。细胞崩溃、脱壁、溶解等是在显微镜下可观察到的细胞死亡现象，同样也不能完全仅依靠这些为依据，否则一些不能迅速发生效应的药物作用易被忽视。应该是凡能引起细胞内相互制约系统中一个或多个环节的紊乱，**终导致细胞功能障碍或细胞生命活动不可逆停止的现象，都应视为细胞死亡的范畴。如氰化物抑制细胞氧化磷酸化阻断ATP供应，氯霉素干扰蛋白质合成抑制细胞修复等，进一步发展，终会导致细胞死亡。#p#分页标题#e##p#分页标题#e#
研究细胞死亡的方式对研究药物作用于细胞的机制是非常重要的。细胞死亡的方式根据病理上的分类有两种形式，一种是细胞坏死，另一种是细胞凋亡，这是指一种有秩序、受控制并按某种预定程序发展的生理性自然死亡过程（参见第十一章）。有的药物可能只通过其中一种形式，而有的药物作用机制可能二者兼而有之。下表列出了二者的一些区别（表13-9）。
表13–9 细胞坏死和细胞凋亡的比较
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细胞坏死 细胞凋亡 |
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细胞形态变化 |
细胞肿胀，细胞质内出现颗粒，核膜破 细胞皱缩，染色质凝聚，质膜小泡，凋亡 |
(5) 细胞增殖和存活测定：前面提到的用台盼蓝染色观察和计算细胞的生长速率，不能反应细胞的增殖情况。如若精确测定细胞的增殖和存活，则需进行克隆形成率（反映细胞的存活率）和克隆大小测量（反应细胞的增殖情况）。
(6) 药物遗传毒性测试：反映化学药物的遗传毒性的检测可以分为四类：DNA损伤、基因突变、细胞遗传学改变（染色体畸变和姐妹染色单体互换）、细胞转化。这些检测呈对一个药物的常规测试。
1)对DNA的损伤检测
方法一：
【原理】
DNA链的断裂呈化学物对DNA造成损伤的一种常见形式。其常作的检测方法是DNA解旋的荧光测定（fluorescntric assay of DNA unwinding，FADU）。其原理是：DNA在变性液里会发生DNA解旋，如果DNA的分子存在链的断裂，这种解螺旋的速度会加快，此时溴化乙锭（EB）在碱性溶液中特异性地嵌入DNA中而引起荧光值增加。通过测定荧光Qd值，即可检测DNA断裂情况。
【操作】
①细胞悬液制备：用常规方法制备细胞悬液，使其细胞浓度为1×106个/ml。实验分为对照组、实验组，对照组设T（未变性）、B（空白）和P（部分变性）三组，实验组只设Pi（部分变性）组，每组三个平行管，每管0.6ml。
②每管细胞中加入0.6ml裂解液（9mmol/L尿素，10mmol/L NaOH，2.5mmo/L EDTA，0.3％ Sarcosyl），待15分钟后细胞裂解，T组加1.2ml抗变性液（1mol/L葡萄糖，14mmol/L巯乙醇），各管沿管壁小心加入变性液I（0.4体积裂解液溶于0.2mol/L NaOH）和变性液Ⅱ（0.4体积裂解液溶于0.2 mol/L NaOH）各0.3ml。然后B管立即超声处理（功率20％）20秒。变性温度和时间为0℃，30分钟，15℃，30分钟，变性时需避光进行。B、P和Pi组各加入溴化乙锭液（1μg/L EB溶于13.3mmol/L NaOH），室温下MPF-4荧光分光光度计荧光测定，条件为激发光波长520nm，荧光波长590nm。
③由T、P、B管荧光值计算残存双链DNA百分数（D）：
D＝[(P—B)／(T—B)]×100％
为获得直线型剂量效应关系曲线引入Qd值：
Qd＝100(1gPo－lgPi)
Qd值大小反映厂DNA链断裂程度的高低，值越大表明断裂越多，式中的Po为未处理细胞D值，Pi为处理的细胞D值。
方法二：
【原理】
当染色体DNA断裂时，分子量与完整的基因组DNA相比比较小，通过离心可与之分离用荧光物质Hoechst33258染色，计算DNA的断裂的比率。
【操作】
①1000g离心收集细胞，细胞沉淀用lml裂解液（10mmol/L Tris-Cl，pH7#p#分页标题#e##p#分页标题#e#.5，1mmol/L EDTA，0.2％TritonX-100）裂解2分钟。
②13 000g离心20分钟，含有断裂的DNA存在上清里，转移上清**一新的管中；而完整的DNA存在沉淀中，用超声破碎。
③向两部分溶液中分别加入等体积的lμg/ml Hoechst33258，37℃染色20分钟。
④于荧光分光光度汁检测，激发光波长360nm，荧光波长450nm，计算断裂DNA占总DNA的百分数。
2) 基因突变的检测；
【原理】
人类和啮齿类动物的正常细胞内X染色体上含有次黄嘌岭—鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HG-PRT），它能代谢嘌呤类似物6–硫代鸟嘌岭（6-TG）或8–氮杂鸟嘌呤（8-AG），形成一种致死性的核苷-5’磷酸盐，从而杀死正常细胞。在致癌物或致突变物的作用下，细胞X染色体上控制的HGPRT结构基因发生突变，不能再产生HGPRT，从而使细胞对6-TG具有抗性，这些细胞能够在含有6-TG的培养液中长成集落。凡能引起碱基替换、移码突变、缺失和基因重组的诱变剂，均能引起HGPRT基因位点突变，这种突变是不可逆的。已经广泛用于辐射剂量估算、遗传毒理学诱变机制等研究。
【操作】
①正常细胞的常规培养，在培养液中加入测试药物，在进行实验时要设立对照组,包括阳性对照（可以用苯并芘）和阴性对照组，而且药物要有浓度梯度。
②37℃培养30小时，加入6μl/ml细胞松弛素B，继续培养42小时。
③弃去培养液，用PBS洗2次。
④细胞悬液经冰醋酸：甲醇（1︰3）固定。
⑤制片，Giemsa染色，显微镜下计数双核和多核细胞数。
⑥计算HGPRTJI基因突变变异子数，即含6-TG培养的1000个细胞中双核或多核细胞数除以不含6-TG培养的1000个细胞中双核细胞数或多核细胞数。其结果反映细胞HGPRT基因损伤情况。基因突变的剂量–效应关系，随致突变剂剂量增加而增加。
3)染色体畸变试验：
【原理】
用于染色体畸变检测的细胞有人和动物的末梢血淋巴细胞，细胞系有中G仓鼠卵巢细胞（CHO）、中G地鼠肺成纤维细胞（V79）和中G仓鼠肺细胞系（CHL）、人胚肺2倍体成纤维细胞，**常用的是外周血淋巴细胞和CHL，在我G新药的染色体畸变试验推荐的**细胞为CHL，其染色体为25条。外周血中的小淋巴细胞几乎都处于细胞周期的G1和G0期，一般条件下不会再分裂，当培养物中加入PHA，在37℃下，经52～72小时的培养，淋巴细胞开始转化，进入细胞增殖周期，此时可获得大量的有丝分裂的细胞。再经过秋水仙素处理，低渗、固定后在显微镜下可以观察到良好的中期染色体分裂象。当电离和化学有害物质作用时均可引起染色体的损伤，且与剂量呈良好的线性关系。
【操作】
①用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，常规细胞培养，把细胞分为五组，即阳性对照组、阴性对照组和三个剂量组。**高剂量和**低剂量相差10倍，中间再设一个剂量，阳性对照物为已知的染色体断裂剂，如丝裂霉素C，剂量为0.02μg/ml；黄曲霉素毒素B，浓度为10-6mol/L等。每组设三个平行样品。
②收集细胞，加入含有PHA的培养基（如果用CHL细胞则不需加），37℃培养52～72小时。
③加入40μg/ml秋水仙素0.05～0.1ml，终溶度为0.4～0.8μg/ml，37℃培养4小时。
④收集细胞，加入8ml 0.075 mol/L KCI低渗液，制成单细胞悬液，37℃、20分钟。
⑤离心收集细胞，加入3ml冰醋酸︰甲醇（1︰3）固定细胞，用吸管轻轻吹打后，立即离心收集细胞。加入10ml冰醋酸︰甲醇（1︰3）处理15分钟。反复操作2次，每次15分钟。
⑥取出冰预冷的载玻片，每片滴加1～2滴细胞悬液，吹散后，自然干燥后，在显微镜下观察有无细胞分裂象。
⑦Giemsa染色15分钟，用自来水冲洗残留液体，干燥后显微镜下观察。进行染色体畸变计数，并摄像。畸变的类型有断片（F）、双着丝粒（D）、环（R）、互换（E）等，电离辐射常见断片、双着丝粒、环等，而化学药物常见单体断裂。结果表示为：
总畸变率(％)＝(各种畸变类型细胞数／分析总细胞数)×100％
畸变率(％)＝(染色体畸变数／染色体总数)×100％
如果采用CHL进行此项实验，其结果判定是：
|
畸变率 结果 |
畸变率 结果 |
|
<5% 阴性(–） |
20% 阳性（++） |
姐妹染色单体互换试验
【原理】
当细胞在加有BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）的培养基中进行有丝分裂时，BrdU能取代胸腺嘧啶核苷酸而掺入到新复制的DNA链中。在经历了两个分裂周期，细胞中期染色体上的两条姐妹染色单体一条被BrdU半取代，即单链取代，另一条的双链都含有BrdU，即双链取代。两者这种差别可借不同的染色方法将其分别开来，双链都含有BrdU的染色单体在Giemsa染色的情况下染色浅，而一股链含有BrdU的染色单体染色深，这种姊妹染色单体上染色深浅相间的现象称为姐妹染色单体分化现象（SCD）。已分化的两条染色单体之间如发生等位点交换的现象，称为染色单体互换（SCE）。
【操作】
①按常规细胞培养方法培养CHO细胞，加入受试物，作用2小时（亦可采用外周血细胞培养，但在培养过程中加入PHA）。
②弃去培养液，用Hanks液洗涤3次。
③加入含BrdU l0μg/ml的完全培养液5ml，于避光条件下培养24～27小时。
④加入秋水仙素1～2滴（终浓度为0.2μg/m1），继续培养4小时后，收集细胞。
⑤按常规用0.075 mol／L KCl低渗、冰醋酸；甲醇（1︰3）固定，制片。
⑥标本在37℃条件下光化24小时后，置于大培养皿中，上盖以擦镜纸，滴加2×SSC液，以溶液不漫没玻片而能保持标本湿润为止。
⑦将大培养皿移**60℃水浴箱上，用20W紫外灯距离5cm垂直照射30分钟。
⑧去掉擦镜纸，以3％Giemsa染液染色15分钟，自来水冲洗，晾干，镜检。
⑨以每个细胞SCE数计算SCE频率，每个样品**少观察25 ~ 50个细胞。
【注意事项】
BrdU溶液**好现配现用，一次用不完，必须用黑纸（布）避光，4℃冰箱内保存。
BrdU溶液强致突变剂，使用浓度不宜太高，在25μg/ml左右的剂量下对细胞增殖无影响。在培养24小时后加入均可。
用紫外线照射诱发姐妹染色单体互换时，如果紫外灯功率大，照射时间应相应减少。
经过t显著性检验后，**少有一个剂量组SCE频率超过对照组2倍，即相当对照组SCE频率3倍者为强阳性；若三个剂量组超过对照组SCE频率且有量效关系，井其中**少有一个剂量组与对照组有非常显著性差异（P<0.001）者为弱阳性，否则为阴性。
5)细胞短期转化试验（药物致癌实验）：细胞转化是细胞发生涉及到DNA或基因改变，导致遗传性状改变的一种变化。细胞发生转化后的性状可以代代相传，能够长期维持和存在。观察药物对细胞是否有诱导转化作用是研究药物是否有致癌作用的常规技术。
【原理】
体外培养的细胞在受电离辐射或化学致癌物的作用下，可发生细胞表型的转化，包括细胞形态转化及生长特性的改变，并形成转化克隆，而且大量实验结果表明，细胞形态学的转化与体内肿瘤生长有密切的关系。一般细胞转化试验的周期需2～3个月，而应用叙利亚金黄地鼠胚胎细胞（SHE）作为靶细胞，经致癌因子作用后第9天即可检测出细胞形态的转化。此试验模型已广泛用于环境致癌物和各种药物未知致痛性的检测，成为细胞毒理学中一个基本的实验方法和手段。
【方法与步骤】
①原代细胞的制备及接种：采用常规建立细胞系的方法，取妊娠10～20天的叙利亚金黄地鼠的胚胎制备原代细胞悬液，接种细胞为1×106个细胞/ml。每个培养瓶加入1ml细胞悬液，2ml完全培养液及双抗，37℃温箱内培养。
②饲养层细胞的准备：直接采用次代培养的SHE细胞制备，每平方厘米生成面积接种3.3×104个细胞，培养基为RPMI–1640或Eagle完全培养液，37℃下培养3～5天。待细胞80％聚集时，进行X射线或60Coγ射线照射，剂量为5.0Gy。照射时细胞培养面朝上，照射后立即用胰蛋白酶消化，然后加入10％小牛血清的完全培养液，调整细胞浓度为2×l04个/mL，接种4×104个细胞（2ml）于一系列25m1培养瓶中。受试物每—浓度组及对照组各12瓶平行样，置37℃下培养24小时后，即可接种靶细胞。因饲养层细胞受到照射，细胞体积大，不增殖，形态特异，易与靶细胞区别开。
也可用地鼠肝细胞制作饲养层细胞，其可使测试系统代谢活化能力提高数十倍**数百倍，而且无细胞毒性。
③靶细胞的制备：取冻存的SHE细胞，作常规培养，当细胞长到80％～90％融合时，即可用胰蛋白酶消化1～1.5分钟，以完全培养液稀释**300个细胞/ml，取1ml细胞悬液接种于饲养层细胞培养瓶中，总体积3ml。37％下培养24小时，加入受试物，可设立三个浓度的实验组，一个阳性对照组（如3-甲基胆蒽，3-MAC或N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍，MNNG），浓度一般为1μg/ml左右。若受试物不溶于水，可先用二甲亚砜溶解，二甲亚砜在培养液中的浓度为0.02％（V/V）。加入受试物后，37℃下连续培养8天，此时细胞既不传代，也不换培养液。
④固定、染色：细胞培养**第9天，弃去培养液，用pH6.8磷酸缓冲液将贴壁细胞洗2次，**后加入甲醇3～5ml固定20分钟，再用Giemsa染液染色20分钟，**后经双蒸水冲洗，晾干。
⑤镜检：在低倍镜下观察细胞转化克隆的形态。转化克隆的成纤维细胞生长无方向性，排列紊乱，形成交叉、旋涡、复层生长（三维空间生长），染色深。正常细胞不形成克隆，或形成的克隆细胞生长有一定方向性，排列规则，基本上单层生长，染色浅。#p#分页标题#e##p#分页标题#e#
⑥转化克隆的判断：为了便于判断克隆是否发生形态转化，可将每个克隆划分为三个区域。中心区：细胞**致密，常呈三维空间生长，细胞界限不清，非转化克隆无此现象。外周区：自中心区边缘向克隆周边延伸，在此区域中细胞单层生长，但排列不规则，形成交叉、重叠，而正常细胞呈方向性生长。细胞稀疏的区域：在克隆外周区之外可有一个细胞群体很稀疏的区域，在此区域内，细胞间隙较大，生长较紊乱，细胞突起重叠，但不典型。此区域中细胞形态不能作为判定转化克隆的依据。
⑦判定阳性结果的标准：根据Dumkel等的建议，SHE细胞准化试验中符合以下标准者即可判定为阳性结果：明确的剂量–效应关系。两个连续剂量组中都有2个或2个以上的转化克隆。单个剂量组中，有3个或3个以上的转化克隆。
若出现以下情况中，仅属可疑阳性：单个剂量组中，只出现1个或2个转化克隆者。在两个不连续的剂量组中，出现1～2个转化克隆者。在两个连续的剂量组中，仅出现1个转化克隆者。
据此尚难做出明确判断者，需做其他实验进行确定，将所形成的克隆分离出来，进行染色体数目和核型分析、细胞凝集实验、半固体琼脂培养基中集落开形成率测定、动物接种致瘤试验，以增强结果的可靠性。其中半固体琼脂培养**为可靠，当动物接种时出现肿物生长并结合病理确诊则**有说服力。
【注意事项】
胚胎原代细胞比传代细胞易转化，同窝动物的胚胎细胞转化结果较稳定。
小牛血清必须及时灭活，无微生物、支原体污染。活力低的血清或污染血清不易使细胞发生转化。
培养液配制保存时间不宜过长，否则会降低细胞转化率。
**接种的细胞密度应高一些，由于接触抑制作用，减少细胞倍增次数，可提高转化率，否则会降低转化率。
第五节 细胞培养在临床中的应用
临床医学是认识和防治疾病、保护和增进人体健康的科学。细胞培养技术在疾病的诊断、治疗上有重要的应用。近年来的细胞培养技术的发展和其他基础医学的理论和技术如分子生物学、物理学、化学等促进了临床医学的蓬勃发展。
一、细胞培养在临床诊断中的应用
1．细胞培养对临床上的病原研究起了很大的推动作用 一些疾病通过细胞培养技术得以发现和确定病原。临床上多种致病病原如细菌、病毒、寄生虫等的确定和药物敏感试验是通过细胞培养技术完成的。如临床上广泛进行的对呼吸道、泌尿生殖道分泌物的病原菌培养和筛选敏感抗生素。通过培养确认病原的方法，人们也新发现和诊断了多种以往不能明确的疾病类型，如艾滋病病毒就是通过细胞培养发现的。使用组织细胞培养技术，可对已知的病毒(如脊髓灰质炎、麻疹病毒、腮腺炎病毒等)进行深入的研究，还有助于发现大量人类未知的肠道和呼吸道病毒，这些病毒在鸡胚和小鼠中并不繁殖。
目前在临床上应用微量全血培养技术进行珍断HIV感染，用于儿童HIV垂直感染的早期诊断及可疑感染者的确认。HIV分离培养是当今HIV垂直感染诊断的依据，早期虽然已有常规培养方法来检测HIV，但这些技术依赖于血液成分的分离，花时间并难以从儿童得到有效血量。血清学检测在<24个月龄的小儿中有一定的局限性，其主要原因是因为24个月内的婴儿体内可能仍存有母体的HIV抗体，而ELISA法不能确定抗HIV抗体是来源于母亲还是婴儿自身产生。为此，Bayliss等人**用微量全血培养法从HIV／AIDS感染者血液中分离出HIV病毒。
2．细胞培养在临床病因诊断中的应用
(1)造血系统疾病诊断：造血或血细胞生成是一个复杂的、多层次的细胞分化生物过程，
包括造血干细胞的自我更新和分化增殖。其分化增殖产生各系列定向造血祖细胞，后者进一步增殖分化产生成熟的血细胞。造血这一过程需要一个适合的微环境，又受到局部和全身的生长因子、抑制因子的调节。造血于祖细胞的研究，可使人们了解造血的正常生理过程，包括其分化、成熟及调节机制。
正常人骨髓中多能造血干细胞约占细胞总数的0.4％，定向祖细胞约占3％。外周血中的比例更低。由于这些细胞在一般形态上与淋巴细胞无明显差别，不能直观地研究其特性。因此主要通过骨髓和血液细胞体外培养的方法，根据其增殖能力和所形成集落的特征不同，将不同的细胞加以区分。现在也可以通过象免疫磁珠等方法先进行干祖细胞的纯化分离，再进行培养扩增。造血细胞的培养分析则已作为造血干细胞克隆性疾病的诊断和治疗效果分析的常用方法。G内外使用的造血细胞培养方法有许多种，按培养基形态可分为液体培养法和半固体培养法；按半固体培养支撑物的种类可分为血浆凝块法、琼脂法和甲基纤维素法；按血清的有无可分为无血清液体培养法和血清半固体培养法等。
造血干细胞可向多种定向祖细胞分化增殖，所以不同类型的造血干细胞克隆性疾病如骨髓增生异常综合征（MDS）、急慢性白血病、再生障碍性贫血（AA）、骨髓增殖性疾病（MPD）等造血细胞的集落分析均有一定特点。目前已发展了多种造血细胞的培养体系，即在常规培养基中应用不同的细胞因子组合用以培养和扩增不同的定向祖细胞。如混合集落形成细胞（CFU-Mix）培养、粒单细胞集落形成细胞（CFU-GM）培养、巨核细胞系集落形成细胞（CFU-MK）培养、红系祖细胞（BFU-E）培养、成纤维细胞祖细胞（CFU-E）分析和骨髓长期培养等。重症再生障碍性贫血患者的骨髓、外周培养血几乎都无集落形成，可认为是CFU-Mix阶段障碍；MDS病人的CFU-GM培养常表现为集落减少而集簇增多；AML骨髓粒–单核系祖细胞（CFU-GM）集落不生成或生成很少，而集簇数目增多。#p#分页标题#e##p#分页标题#e#
(2)与染色体变化相关疾病的诊断：染色体分析亦称核型分析（karyotype analysis），是在细胞培养的基础上发展起来的一项专门技术。目前随着显带技术的应用以及高分辨率染色体显带技术的出现和改进，能更准确地判断和发现更多的染色体数目和结构异常综合征，如21三体综合征等，还可以发现新的微畸变综合征。染色体分析标本的来源，主要取自骨髓、外周血、绒毛、羊水中胎儿脱落细胞和脐血、皮肤等各种组织。由于只有处于中期的染色体才能在光学显微镜下看到它的独特结构，因此染色体分析均需用正在分裂的细胞。体内一般只有骨髓细胞含有足够比例的处于有丝分裂的细胞，其他细胞均需要通过一定条件的培养使之达到分析的要求。外周血淋巴细胞因其容易获得，也常用于体细胞染色体畸变的细胞遗传学分析。一般来说，在有分裂原（如植物血凝素、美洲商陆分裂素或伴刀豆球蛋白A）存在的情况下，培养肝素化的血细胞以刺激非周期的淋巴细胞，之后用秋水仙素处理使其停止在分裂中期相，然后用低渗培养液处理，使细胞核体积涨大，**后用甲醇／冰乙酸固定细胞并制片，用Giemsa染色或进行染色体G显带分析。
染色体分析是产前诊断的主要内容之一。近20余年来，遗传学家对大量流产儿进行了与遗传有关的细胞核内染色体的研究，发现50％～60％的流产儿具有异常染色体，包括数目异常和结构异常。这些染色体异常导致了胚胎发育的障碍，造成妊娠中断。临床上对多次流产、曾生育过先天愚型、在妊娠早期有明显致畸因素接触的夫妇，都建议做产前宫内诊断。如可在妊娠15～17周时羊膜囊穿刺进行羊水的化学分析和羊水细胞的染色体分析；妊娠8周时即可进行绒毛膜活检诊断胚胎的染色体异常，达到早期诊断的目的。通过这些产前诊断方法，可将有遗传病或先天畸形的胎儿筛查出来，进行选择性流产，控制多种遗传病的垂直遗传，达到生育健康后代的目的。
除产前诊断外，染色体分析更多的是用于肿瘤的细胞遗传学研究。现代肿瘤细胞遗传学的一个主要结论是，肿瘤细胞的核型变化是不一致地分布在整个染色体组中，不同的肿瘤与不同的染色体区、带有关系。即肿瘤的发生与非随机性染色体异常密切相关。截**目前，80％以上的肿瘤特异性细胞遗传学异常，是在血液系统肿瘤发现和被研究的，因此细胞遗传学检查已成为临床诊断白血病、判断预后和观察治疗效果的重要方法学之一。
Ph染色体是**早发现特异性地与恶性肿瘤有关的异常染色体，早在1960年Nowell和Hungerford就在慢性髓细胞性白血病（CML）中发现了特征性Ph小体，1972年芝加哥大学**细胞遗传学家Rowley证实，Ph染色体是由第9号染色体和第22号染色体交互易位所致。其后的分子生物学研究又进一步证实了这两条染色体易位的结果是22号染色体上的BCR基因与9号染色体上的ABL。基因相融合，后来的动物实验则表明了BCR–ABL融合基因正是造成CML发病的原因。由于在90％以上的慢性髓细胞性白血病病人中可以检测到该异常染色体和融合基因，且其异常染色体的比例和融合基因的数量与治疗效果和疾病状态密切相关，对该染色体的检查已作为疑诊和已确诊CML病人的常规检查。
20世纪80年代以来，染色体分析发现90％急性白血病有核型异常，特别是染色体易位，因而提出了白血病的MIC（形态学、免疫学、细胞遗传学）分型方法。目前认为急性髓性白血病（AML）中较常见的依次为t（8；21)、[（15；7）、inv（16）/del（16）、t（9；22）等，尤其发现85％左右M2b存在t（8；21），90％以上急性早幼粒细胞白血病（APL）有t（15；17）易位。从染色体易位的断裂点已经分离出确切的融合基因，如t（8；21）的AML/ETO融合基因，t（15；17）的PML-RARa融合基因，t（9；22）的BCR–ABL融合基因，以及与11号染色体有关的MLL等。
(3)疾病预后：细胞培养在诊断疾病的预后也具有一定的作用。如重症再生障碍性贫血的病人，其骨髓集落培养，BFU–E的减少与病情严重程度是一致的；AML病人的在用药物后缓解后，如果骨髓的CFU–GM培养检测，原本减少的集落又恢复生长，而当复发前集落又减少，所以对估计预防复发也有一定的意义。
细胞遗传学分析提供了一些非常有用的预后信息。AML中预后较好的细胞遗传学异常包括t（8；21）、inv（16）、t（15；17）。如有特征性的染色体5q，7q缺失或单倍体3号染色体的易位或者倒位，t（6；9）、t（9；22）及染色体11q23异常，均提示AML病人预后差。急性淋巴细胞白血病（ALL）中Ph染色体阳性者占约30％，预后不良。
二、细胞培养在临床治疗中的应用
运用细胞进行疾病的治疗是20世纪医学的一大进步，它使得一些传统的治疗方法束手无策的疾病得到改善，甚**治愈。这种疗法称体细胞治疗，它是指应用人体、异体或异体（非人体）的体细胞，经体外操作后回输（或植入）到人体的疗法。传统的全血输注、成分输血、自体和异基因骨髓移植、脐血移植等均属于体细胞治疗的范围。这些方法主要涉及细胞的采集、保存和运输。
体细胞治疗的类型可以分为三类：①细胞的输入和植入，旨在体内释放某些因子，如酶、细胞因子、凝血因子等。②输入激活的淋巴细胞，如淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK）或肿瘤浸润淋巴细胞（TIL），以及其他能杀伤肿瘤的细胞。③植入经过体外操作的细胞群，如肝细胞、肌细胞、干细胞、胰岛细胞等，以求其在体内发挥复合生物活性作用。干细胞的研究与应用被美G《Science》杂志为1999年世界十大科技成果之一，取自人胚胎或骨髓的干细胞可用于培育不同的人体细胞、组织或器官，这有望成为移植器官的新来源。组织器官移植有可能成为21世纪人类攻克某些重大疾患（如心脑疾病、血液系统疾病等）的根本措施。#p#分页标题#e##p#分页标题#e#
下面介绍一些临床常用的细胞培养和扩增。
1．造血祖细胞体外培养和扩增 造血干细胞自我更新的性能使其复制方式为不对称分裂，且缺乏可靠的人类干细胞定量检测方法，因此，目前还难以对造血干细胞的扩增进行准确评估，但CD34+造血祖细胞具有良好的扩增反应。这种扩增具有很好的临床应用前景，一方面可以解决常规异体移植的配型以及移植物抗宿主反应，另一方面由于采用少量病人的血液，可以避免自身肿瘤细胞污染、供血量不足等问题。
取骨髓、动员外周血、脐带血，用淋巴细胞分离液分离的单个核细胞，用20％马血清MEM培养基制成单细胞悬液，应用流式细胞仪进行CD34+细胞的筛选。CD34+细胞在SCF、IL-1、IL-3、IL-5、GM-CSF、C-CSF、EPO、PIXY321等细胞因子的不同组合刺激下，经8~14天即可扩增细胞总数30～1000倍，集落形成细胞（包括CFU-GM、BFU-E、CFU-GEMN）也可被扩增41~190倍。但这些因子的组合在扩增造血细胞的同时，也明显地加速了造血干／祖细胞的分化，**21天时，jue大部分细胞已分化为较成熟的血细胞，因此，如何在扩增造血细胞的同时，又尽可能地保留造血干细胞并扩增早期造血祖细胞，使其在数量上和功能上满足临床治疗的需要，这就成为体外扩增研究的重点。近年来，经过各G学者的不断努力，此方面的研究已取得了明显的进展，已经有报道，白血病人经过大剂量化疗后，应用其外周血扩增的细胞可以重建病人的造血系统。
2．造血祖细胞定向诱导分化 扩增造血祖细胞的同时，也明显的加速了其分化，这是造血祖细胞扩增所面临的一个难题，但同时又为我们展开了一个新的研究*域，即利用造血干／祖细胞具有多向分化的潜能，通过细胞因子的不同组合，定向的诱导其分化，产生大量所需的功能细胞（如红细胞、粒细胞、血小板、树突状细胞、NK细胞、淋巴细胞等），满足基础研究及临床应用的需要，这在新一代的细胞免疫治疗中将具有十分重要的意义。
(1) 粒系和红系细胞的定向诱导分化：裴雪涛等利用SCF+IL-3+G-CSF+GM-CSF／或TPO的组合诱导CD34+细胞向粒系分化，5～7天后体系中的粒细胞生长呈现优势，10天时CFU-GM增加了12.87～14.46倍，且出现大量的中性粒细胞；而SCF+ IL-3+EPO+TPO则可扩增BFU-E 15倍，同时体系中出现大量血红蛋白分泌及网织红细胞。
(2) 巨核细胞和血小板的定向诱导分化：TPO对巨核系造血祖细胞的增殖分化、血小板的生成及系特异性标志的表达均具有明显的刺激作用。裴雪涛等利用因子SCF+IL-3+IL-6+TPO进行CFU-MK和细胞CD4la+扩增，于第14天达17～35倍。此外，TPO还可加速CFU–MK进一步分化成熟，诱导巨核细胞在胞浆内形成凸出的界膜系统、血小板特异性颗粒及“血小板区”，**终分裂形成血小板。
(3) 树突状细胞（DC）的定向诱导扩增：DC是体内**有效的抗原提呈细胞（APC）之一，通过其表面的B7、MHC–Ⅱ类分子、ICMC–1等共刺激分子，激活T辅助细胞，促使其分泌IL-2等细胞因子，并传递特异性抗原信号，**终激活细胞毒T细胞（CTL）。因此，在肿瘤免疫及其治疗中具有重要意义。
(4) LAK细胞、NK细胞和淋巴细胞的定向诱导分化：单用IL-2即可在6～8天诱导CD34+细胞形成NK细胞，CD3-CD56+NK细胞可扩增3～5.4倍，诱导扩增的NK细胞可诱发移植物抗肿瘤效应（GVT），且对CD34+细胞无明显影响，SCF、IL-3、IL-15等细胞因子对NK细胞的诱导扩增具有协同作用。目前在临床上，外周血白细胞经IL-2诱导转化为LAK细胞，已经成为继手术、放疗、化疗后的又一种肿瘤治疗方法。
(5) 其他细胞的定向诱导分化：造血干细胞以及更早期的间质干细胞可在体外被诱导分化为造血基质细胞、骨、肌肉、软骨、肌腱、韧带等细胞和组织，从而使新一代细胞治疗的范围更加广阔。
3．自体细胞因子诱导的杀伤细胞 G内陆道培等报道应用自体细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）治疗白血病37例，58例次CIK治疗，及部分白血病合并丙型病毒性肝炎的效果。采用血细胞分离机大量采集患者的外周血单个核细胞，再用抗CD3单杭、白细胞介素2、干扰素γ培养l0天左右，然后将细胞洗涤后经静脉回输给患者。认为自体CIK细胞治疗具有明显清除微小残留白血病细胞、防止复发的作用，静脉输注安全。并且该治疗具有明显抑制甚**清除白血病患者合并丙型肝炎病毒感染的作用，可明显改善患者的肝功能。
4．肿瘤细胞疫苗 通过体外细胞培养获得肿瘤疫苗一直是人们期待的一种肿瘤主动免疫治疗手段。虽然目前仍然多在试验阶段，其中一些已展示出临床应用的乐观前景。如回输患者自身的在体外经基因修饰的肿瘤细胞，小鼠中的实验表明转染G–CSF的肿瘤细胞可以诱发机体对肿瘤细胞的特异性细胞免疫。近年来对树突状细胞（DC）作为肿瘤疫苗的研究正如火如荼，DC与肿瘤细胞相关抗原、肿瘤细胞裂解物或肿瘤抗原肽（包括合成肽）体外共同孵育，负载了肿瘤抗原的“抗原肽DC瘤苗”、转基因DC瘤苗、DC与肿瘤细胞的融合瘤苗等均在动物实验和人体外试验中显示了良好抗肿瘤主动免疫效果。
5．皮肤细胞培养 在皮肤受到严创伤、烧伤、烫伤时，大面积深度皮肤缺损创面不能自行修复，需要进行皮肤移植。当自体皮肤不能满足需要时，需要用异体皮肤和人工皮肤。异体皮肤由于排斥反应，一般经2～3周后即发生溶解脱落。人工皮肤是采用组织工程学和细胞生物学的原理与方法，在体外重组的具有生物学活性的皮肤类似物，按组成成分不同可分为单纯人工真皮和具有表皮细胞层的活性复合皮。目前，已研制成功多种人工真皮，如来源于异体或异种（猪）皮的无细胞真皮、以胶原为主要原料经冷冻干燥后形成的海绵状胶原膜，还有透明质酸膜、聚乳酸／聚羟基乙酸网状膜等。它们的基本特点是抗原性弱，生物亲和性好，植入创而后降解慢，可诱导自体的成纤维细胞、血管内皮细胞及新生毛细血管浸润生长，形成新的、胶原纤维排列规则的真皮样组织，从而重建真皮层。复合皮则是以各种人工真皮为载体，取病人很小的一块皮肤，分离其中的表皮细胞，在培养箱中培养，不断进行传代扩增，将扩增的细胞象播种一样接种在人工真皮上，再培养一段时间，就可以形成含4～6表皮细胞层和真皮层的夹心汉堡包式的人工皮。从理论上分析，取4～20cm#p#分页标题#e##p#分页标题#e#2自体皮片的表皮细胞于体外培养2～3星期，可形成1000～10 000cm2的人工皮肤。由于复合皮同时含有表皮与真皮层，从而避免了单纯表皮细胞膜片移植不耐磨、易收缩、存活率低的缺陷，又避免了单纯人工真皮移植仍需移植自体薄皮片的不足。所以，从结构与功能上看，复合皮构成了相对完整的皮肤。所以从严格意义上来说，复合皮才是名正言顺的人工皮肤。除烧伤外，在大面积的皮肤撕脱伤、瘢痕、慢性难愈性皮肤溃疡、面部软组织凹陷等治疗中，人工真皮也能发挥较好的作用，使创面修复质量明显提高。复合皮的应用可望为大面积皮肤损伤病人提供充足的皮源，并改善创面愈合质量。
6．试管婴儿 由于培养技术和胚胎学研究的发展，生殖医学理论及其临床高科技技术也取得了长足进步。出现了试管婴儿技术，这不仅给治疗不孕增添了新的方法和手段，而且也使生殖医学基础理论和生命科学研究进入一个崭新的*域。**代试管婴儿，是英GEdwards与Steptoe医生创立的经体外受精与胚胎移植，简称IVF-ET。此技术对妇女输卵管不通所致的不孕提供了新的治疗方法。第二代试管婴儿，显微受精技术，它包括透明带部分切割技术、透明带受精技术和单精子卵泡浆内显微注射受精技术。由于前二者的成功率比较低，所以第二代试管婴儿主要呈指单精子卵泡浆内显微注射受精技术（ICSl），适用于重度男性因素不孕治疗。第三代试管婴儿，是指胚胎植入前遗传学诊断（PGD），此技术是在体外受精，当受精卵发育到6～8细胞期时．采用显微技术取出1～2个细胞，采用基因分析或FISH技术，进行遗传病诊断，去除有病的胚胎，植入正常胚胎而发育。此技术对预防遗传病优生优育发挥重要作用。
提高种植率是试管婴儿技术的重点，其关键在于胚胎培养和囊胚培养技术。
(1) 胚胎培养：
1）胚胎培养液；现在，市面上有多种胚胎培养液出售（表13-10），其应用方法和受精率、妊娠率无明显差异。目前G内应用**普遍的是HTF和IVF系列，其有效期短，到货后有效期往往只有3～4周，容易造成短缺或浪费。Q-HTF系列有期较长，根据有些中心应用情况看，胚胎碎片较多，但临床妊娠率并不低。各个生殖中心可以根据实际情况适当搭配应用。
表13-10 常用胚胎培养液
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名称 生产公司 有效期 特点 |
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HTF Irvine Scientific 3个月 不含HSA |
2） 胎培养方法：目前多数中心培养胚胎**第三天移植，采用微滴法胚胎培养，也有一些中心认为采用4孔扳胚胎集中培养有助于胚胎生长，每孔内2～3个胚胎一起培养。原石木郎的研究发现，第三天以前胚胎单个培养较好，而第三天以后胚胎联合培养有助于囊胚形成。
有的生殖中心采用微滴法，卵裂率89％，第三天有8个细胞胚胎可供移植占74.9％。胚胎培养注意问题：①市面出售的胚胎培养液内含碳酸盐缓冲液，孵育时松开瓶盖，可使CO2进入，新瓶液体取出后**好分装，避免多次单开瓶口；②去除颗粒细胞的当天，用已经平衡好的培养液滴人生长皿（一般用Falconm皿 3001），每皿6～8滴，每滴25μl，覆盖矿物油约2ml；
③ 每滴内一般放一个胚胎。
(2) 囊胚培养：生理情况下，胚胎在输卵管内受精后发育**囊胚时进入子宫进一步卵裂、孵育、着床。改变胚胎移植回子宫的时间，被认为是提高胚胎种植率的方法之一。自1987年以来，移植用的胚胎主要是受精后第2～3天的4～8细胞胚胎。其原因是培养液以及囊胚培养条件的限制造成的。近来出现的序贯培养液，为囊胚移植提供了有利条件，使第5天移植成为可能。#p#分页标题#e##p#分页标题#e#
1） 培养条件：5%CO2、5%O2、90%N2培养系统降低了氧浓度，低氧环境使氧自由基产物减少，并可破坏或结合培养基中的某些毒素。空气中20%的氧深度不是胚胎**适宜的环境，动物实验提示胚胎在低氧环境下种植率提高。日前对这一系统是否有利于培养囊胚的形成仍存在争议，Noda**报道了在低氧环境下，Ealre’s液中培养的胚胎及胚胎移植结局好转。对低氧环境培养体系这一新的手段尚在评价之中。
在囊胚培养中要求培养基满足胚胎在体外不同发育阶段生长的需要。胚胎卵裂早期需要微量的葡萄糖，胚泡晚期需要大量的葡萄糖，对丙酮酸的需求则相反。抗氧化牛黄酸对胚泡的发展是有价值的，次黄嘌岭是有害的。晚期桑椹胚和胚泡阶段胚胎需要非必需氨基酸和必需氨基酸，大约在第3天胚胎基因开始活化并转录，若没有上述氨基酸，必将阻滞囊胚的形成。囊胚培养早期（第3天以前的卵裂阶段），胚胎放在简单介质（如G1）中生长，然后，当胚胎基因开始活化后，再将胚胎转移到合适介质如（G2中）培养，其中不仅包括含盐、能量底物和蛋白质，而且还有氨基酸、维生素和激素。目前囊胚培养基有多种，如G2、P2、Quinn囊胚培养基等。
2） 培养方法：
方法一：共培养法
共培养法是指用单层细胞作为饲养层细胞，与胚胎共培养，模拟体内发育，促进囊胚的发育。目前，共培养所用的细胞有人输卵管壶腹部细胞、vero细胞（输卵管上皮细胞）、胎牛子宫纤维母细胞、牛输卵管上皮细胞、人子宫内膜细胞、卵丘细胞及卵巢癌细胞。共培养法的动物实验开始于20世纪80年代早期，到了90年代对人类胚胎的共培养液进行了大量的研究，人类的胚胎输卵管细胞上进行受精和生长（共培养），能够使胚胎的活力提高。
共培养对囊胚形成有重要意义，但在IVF*域存在较大争议，主要有以下几个原因：①细胞捐赠人可能的疾病传播以及利用动物细胞的伦理问题；②由于共培养系统较复杂，且作用机制尚未能够明确和对应用的有效性**今仍有争议；③由于其培养体系复杂，可能产生对胚胎的污染。近年来，共培养已逐渐被序贯培养所代替。
方法二：序贯培养法
序贯培养法已经形成并取得了较大的发展，取代联合培养系统。序贯培养注意到了人体外培养的胚胎再不同时间里对代谢需求各不相同，即移植前胚胎的营养成分需要改变。对不同发育时期的胚胎用不同的培养基，而每种培养基适合该时期胚胎发育的营养需要。Gardner发展了G1.2、c2.2序贯培养基，他们建立了这两种培养基的序贯培养系统。G内一些生殖中心也使用G1.2、G2.2序贯培养基培养人囊胚，取得了较满意的结果。
3）囊胚培养步骤（其中前三天为胚胎培养）：
①超促排卵，卵子经4～6小时体外培养成熟。
②体外受精，按10万条/m1密度将精子加入有卵子的培养孔中，18～20小时后，根据原核及第二极体数检查受精情况。如果是通过ICSI，取卵后2小时左右，用0.5mg/ml透明质酸酶将卵子外的卵丘消化，再用拉制的玻璃细管将卵子外的颗粒细胞去除。检查卵子的完好及成熟度，对有**极体的核成熟卵子行ICSI。先将精子置于5%的聚乙烯吡咯烷酮中，经尾部制动后，尾端向前吸人微注射针中，转移**含HEPEs的HTF管中，保持卵子**极体于6点或12点位置，由3点进针，抽吸少量胞浆以确定卵膜穿透后，将精子置于卵胞浆中央。ICSI后，卵子转移**HTF培养基中培养，次日检查受精情况。
③第3天，观察胚胎，如果8细胞I～Ⅱ级胚胎数大于3个，胚胎转入已经平衡过夜的囊胚培养皿内，评级高的胚胎集中培养，碎片含量较多或细胞大小不一胚胎单个培养。第3天胚胎未达到上述标准者，当天移植回子宫。
④检查囊胚形成率并进行评分，选择移植或冷冻用胚胎。取卵后第5天，评估胚胎质量，确定胚胎能否用于移植和冷冻。如果再第5天，不能形成囊胚，换液后胚胎继续培养1天．在第6天评估是否能用于移植和冷冻。迟于第7天上午形成囊胚者不能再继续培养。
