常用设备
准备室的设备：
单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜（放置未消毒物品）、储品柜（放置消毒过的物品）、包装台。配液室的设备：扭力天平和电子天平（称量药品）、 PH 计（测量培养用液 PH 值）、磁力搅拌器（配置溶液室搅拌溶液）。
培养室的设备：
液氮罐、储品柜（存放杂物）、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱（ -80℃ ）、空调、二氧化碳缸瓶、边台（书写实验记录）。
必须放在无菌间的设备：
离心机（收集细胞）、超净工作台、倒置显微镜、 CO2 孵箱（孵育培养物）、
水浴锅、三氧消毒杀菌机、 4℃ 冰箱（放置 serum 和培养用液）。
无菌操作基本技术
无菌室的灭菌：
1.定期打扫无菌室：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用 3‰ 来苏尔或者新洁尔灭或者 0.5 ％过氧乙酸擦拭。
2.CO2 孵箱（
培养箱）灭菌：先用 3‰ 新洁尔灭擦拭，然后用 75 ％酒精擦拭或者 0.5 ％过氧乙酸，再用紫外灯照射。
3.实验前灭菌：打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各 20-30 分钟 。
4.实验后灭菌：用 75 ％酒精（ 3‰ 新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。
5.定期检测下列项目：钢瓶之CO2 压力；
CO2培养箱之CO2浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)；无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300 小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。
6.水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。
实验人员的无菌准备：
1.肥皂洗手。
2.穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋
3.用75 ％酒精棉球擦净双手。
无菌操作的演示：
1.凡是带入超净工作台内的酒精、 PBS 、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用 75 ％酒精擦拭瓶子的外表面
2.靠近酒精灯火焰操作。
3.器皿使用前必须过火灭菌
4.继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。
5.各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸。
6.吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。
器械的清洗和消毒
玻璃器械洗消：
一、新的玻璃器皿的洗消：
1.自来水刷洗，除去灰尘。
2.烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入 5 ％稀盐酸中 12 小时以除去脏物、铅、砷等物。
3.刷洗、烘干： 12 小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。
4.泡酸、清洗：用清洁液（重铬酸钾120g ：浓硫酸 200ml ：蒸馏水 1000ml ）浸泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗 15 次，**后蒸馏水冲洗 3-5 次和用双蒸水过 3 次。
5.烘干、包装：洗干净后先烘干，然后用牛皮纸（油光纸）包装。
6.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子，打开开关和安全阀，当蒸气成直线上升时，关闭安全阀，当指针指向 15 磅 时，维持 20-30 分钟。
7.高压消毒后烘干
二、旧的玻璃器皿的洗消：
1.刷洗、烘干：使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏尔液或洗涤剂溶液中，泡过来苏尔溶液（洗涤剂）的器皿要用清水刷洗干净，然后烘干。
2.泡酸、清洗：烘干后泡入清洁液（酸液）， 12 小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗（避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗），再用蒸馏水冲洗 3 次。
3.烘干、包装：洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸（油光纸）等包装，以便于消毒储存及防止灰尘和再次被污染。
4.高压消毒：包装好的器皿装入高压锅内，盖好盖子，打开开关和安全阀，随着温度的上升安全阀冒出蒸气，当蒸气成直线冒出 3-5 分钟后，关闭安全阀，气压表指数随之上升，当指针指向 15 磅 时，调节电开关维持 20-30 分钟即可。（玻璃培养瓶消毒前可将胶帽轻轻盖上）
5.烘干备用：因为高压消毒后器皿会被蒸气打湿，所以要放入烤箱内烘干备用。金属器械洗消：金属器皿不能泡酸，洗消时可先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用 75 ％酒精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲洗，再烘干或空气中晾干。放入铝制盒内包装好在高压锅内 15 磅 高压（ 30 分钟）消毒，再烘干备用。
橡胶和塑料：
橡胶和制品通常处理方法是：先用洗涤剂洗刷干净，再分别用自来水和蒸馏水冲干净，再用烤箱烘干，然后根据不同品质进行如下的处理程序：
1.针式滤器帽不能泡酸液 , 用 NaOH 泡 6-12 小时 , 或者煮沸 20 分钟 , 在包装之前要装好滤膜两张，安装滤膜时注意光面朝上 ( 凹向上 ) ，然后将螺旋稍微拧松一些，放入铝盒中在高压锅内 15 磅 30 分钟消毒，再烘干备用。注意在超净台内取出使用时应该立即将螺旋旋紧。
2.胶塞烘干后用 2 ％氢氧化钠溶液煮沸 30 分钟（用过的胶塞只要用沸水处理 30 分钟），自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液 30 分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。**后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。
3.胶帽，离心管帽烘干后只能在 2 ％氢氧化钠溶液中浸泡 6-12 小时（切记时间不能过长），自来水洗净，烘干。然后再泡入盐酸液 30 分钟，再用自来水，蒸馏水，三蒸水洗净，烘干。**后装入铝盒内高压消毒，烘干备用。#p#分页标题#e##p#分页标题#e#
4.胶头可用 75 ％酒精浸泡 5 分钟，然后紫外照射后使用即可。
5.塑料培养瓶，培养板，冻存管.
6.其他消毒方法：有的物品既不能干燥消毒，又不能蒸气消毒，可用 70 ％酒精浸泡消毒。塑料培养皿打开盖子，放在超净台台面上，直接暴露在紫外线下消毒。也可用氧化乙烯消毒塑料制品，消毒后需要用 2—3 周时间洗除残留的氧化乙烯。用 20000—100000rad 的 r 射线消毒塑料制品效果**好。为了防止清洗器材已消毒与末消毒发生混淆，可在纸包装后，用密写墨水作好标记。其法即用沾水笔或毛笔沾以密写墨水，在包装纸上作一记号，平时这种墨水不带痕迹，一经高温，即出现字迹，从而可以判定它们是否消毒。密写墨水的配制：氯化钻 (CoC12·6H2o) 2g ，30％盐酸 10m 1，蒸馏水 88m1 。
注意事项：
1.严格执行高压锅的操作规程：高压消毒时，先检查锅内是否有蒸馏水，以防高压时烧干，水不能过多因为其将使空气流畅受阻，会降低高压消毒效果。检查安全阀是否通畅，以防高压时爆炸。
2.安装滤膜时注意光面朝上：注意滤膜光滑一面是正面，要朝上，否则起不到过滤的作用。
3.注意人体的防护和器皿的完全浸泡： A. 泡酸时要戴耐酸手套，防止酸液溅起伤害人体。 B. 从酸缸内捞取器皿时防止酸液溅到地面，会腐蚀地面。 C. 器皿浸入酸液中要完全，不能留有气泡，以防止 泡酸不彻底。
细胞培养用液的配制与消毒
器材与试剂：
干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素 . 纯净水系统、电子天平、 PH 计、磁力搅拌器。
具体步骤：
一、水的制备：
细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水。
二、PBS 的制备与消毒 ( 也可用于其它 BSS ，如： Hanks ， D-Hanks 液的配制 ) ：
1.溶解定容：将药品（ NaCl 8.0g ， KCl 0.2g ， Na2HPO4·H2O 1.56g ， KH2PO40. 2g ）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容** 1000ml ，摇匀即成新配制的 PBS 溶液。
2.移入溶液瓶内待消毒：将 PBS 倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内 8 磅 消毒 20 分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。
三、胰蛋白酶溶液的配制与消毒：
胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在 pH 为 8.0 、温度为 37℃ 时，胰酶溶液的作用能力**强。使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。因 Ca2+ 、 Mg2+ 和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含 Ca2+ 、 Mg2+ 的 BSS ，如： D-Hanks 液。终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。
1.称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为 0.25 ％，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调 PH 到 7.2 左右）或 PBS （ D-hanks ）液中。搅拌混匀，置于 4℃ 内过夜。
2.用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（ 0.22 微米微孔滤膜）抽滤除菌。然后分装成小瓶于 -20℃ 保存以备使用。
四、抗生素溶液的配制
1.所用纯净水（双蒸水）需要 15 磅 高压 20 分钟灭菌。
2.具体操作均在超净台内完成。青霉素是 80 万单位 / 瓶，用注射器加 4ml 灭菌双蒸水。链霉素是 100 万单位 / 瓶，加 5ml 灭菌双蒸水，即每毫升各为 20 万单位。
3.使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度**终为 100 单位 /ml 。 1 单位＝ 1 微克？
4.细胞库之细胞培养基不加抗生素
5.培养自ATC引进之细胞株，培养基中不加抗生素。
6.培养自其它实验室引进之细胞株，制作token freeze 前培养基须添加抗生素，待token freeze 通 过污染测试后，大量培养时则不加抗生素。
7.寄送活细胞时，须将培养液充满整个 flask 时，则须添加抗生素 。 (penicillin 100 units/ml +
streptomycin 100 ug/ml)
8.若要检测mycoplasma，则培养基内不可添加gentamicin，因gentamicin 会抑制 mycoplasma 生长。
9.去除细菌污染之抗生素混合配方 : penicillin 250 units/ml, streptomycin 250 ug/ml,
neomycin 250 ug/ml, bacitracin 2.5 units/ml
注意混合使用后药物毒性会增强。
10.抗生素使用种类与浓度：
工作浓度. 储存温度. 杀灭细菌
penicillin 100 units/ml -20℃ G(+) bacteria
streptomycin 100 ug/ml -20℃ G(+) and G(-) bacteria
chlotetracycline 50 ug/ml -20℃ G(+) and G(-) bacteria
gentamicin 50 ug/ml -20℃ G(+) and G(-) bacteria, mycoplasma
amphotericin B 2.5 ug/ml -20℃ yeast and molds
nystatin 50 ug/ml -20℃ yeast and molds
fungizone 2.5ug/ml -20℃ yeast and molds
五、RPMI1640 的制备与消毒：
1.溶解、调 PH 值、定容：先将培养基粉剂加入培养液体积 2/3 的双蒸水中 , 并用双蒸水冲洗包装袋 2-3 次 ( 冲洗液一并加入培养基中 ), 充分搅拌**粉剂全部溶解 , 并按照包装说明添加一定的药品 . 然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各 0.5ml, 使青链霉素的浓度**终各为 100 单位 /ml 。然后用一个当量的盐酸和 NaOH 调 PH 到 7.2 左右。**后定容** 1000ml ，摇匀。#p#分页标题#e##p#分页标题#e#
2.安装蔡式滤器：安装时先装好支架，按规定放好滤膜，用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。
3.抽滤：配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。
4.分装：将过滤好的培养液分装入小瓶内置于 4℃ 冰箱内待用。
5.使用前要向 100ml 培养液中加入 1ml 谷氨酰胺溶液（ 4℃ 时两周有效）。
六、血清：
1.血清的灭火：细胞培养常用的是小牛血清，新买来的血清要在 56℃ 水浴中灭火 30 分钟后，再经过抽滤方可加入培养基中使用。
血清必须贮存于–20 ～ -70℃，若存放于4℃，请勿超过一个月。如果一次无法用完一 瓶，可将40～45 ml 分装于无菌50 ml 离心管中，由于血清结冻时体积会增加约10 %，必须预留此膨胀体积之空间，否则易发生污染或容器冻裂之情形。
2.一般厂商提供之血清为无菌，不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物，则可将血清入培养基内一起过滤，勿直接过滤血清。
3.瓶装(500ml) 血清解冻步骤(逐步解冻法): -20℃ 或–70℃ **4℃冰箱溶解**，**室 温下全溶后再分装，一般 50 ml 无菌离心管可分装40～45 ml。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡 ，使温度与成分均一，减少沈淀的发生。勿直接由－２０ ℃ 直接 **３７ ℃ 解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沈淀。
4.heat-inactivation 是指56 ℃, 30 分钟加热已完全解冻之血清。加热过程中须规则摇晃均匀。此热处理之目的是使血清中之补体成份(complement) 去活化。除非必须，一般建议作此热处理，因为会造成沈淀物之显著增多，且会影响血清之品质。补体参与之反应有：cytolytic activities, contraction of smooth muscle, release of histamine from mast cells and platelets, enhanced phag℃ytosis, chemotaxis and activation of lymph℃ytic and macrophage cell type。
5.勿将血清置于３７℃太久，若在３７℃ 放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之品质。
6.血清之沉淀物
6.1 凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 变性 及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin) 造成，这些凝絮沈淀物不会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沈淀物，可用离心3000 rpm, 5 min 去除，或离心后上清液可以加入培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沈淀物，因为会阻塞过滤膜。
6.2 显微镜下观察之“小黑点”：通常经过热处理之血清，沉淀物的形成会显著的增多。有些沉淀物在显微镜下观察像是小黑点 ，常会误认为血清遭受污染，而将血清放在３７℃中欲培养此微生物“，但在37 ℃ 环境下，又会使此沈淀物增多，更会误认为微生物之增殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。一般而言，此黑点应不会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品应立即停用，更换另一批号的血清。
七、HEPES 溶液：
HEPES 的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸（ N'-a-hydroxythylpiperazine-N'- ethanesulfanic acid ）。对细胞无毒性作用。它是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的 pH 范围。使用终浓 度为 10-50mmol/L ，一般培养液内含 20mmol/LHEPES 即可达到缓冲能力。
1mol/L HEPE 缓冲液配制方法如下：
准确称取 HEPTS 238.3g ，加入新鲜三蒸水定容** 1L 。过滤除菌，分装后 4℃ 保存。
注意：因为现在市售 HEPES 为约 10g 包装的小瓶，所以可根据实际情况灵活配制，但是要保证培养液内 HEPES 的终浓度仍然为 20m mol/L 。如：称取 4.766 克 HEPES 溶于 20ml 三蒸水中，过滤除菌后可完全（ 20ml ）加入 1L 培养液中，或者每 100ml 培养液中加入 2ml 即可。
八、谷氨酰胺：
合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚**死亡。在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定， 4℃ 下放置 1 周可分解 50 ％，故应单独配制，置于 -20℃ 冰箱中保存，用前加入培养液。加有谷氨酰胺的培养液在 4℃ 冰箱中储存 2 周以上时，应重新加入原来的谷氨酰胺。一般培养液中谷氨酰胺的含量为 1 ～ 4mmol/L 。可以配制 200mmol/L 谷氨酰胺液贮存，用时加入培养液。配制方法为，谷氨酰胺 2.922g 溶于三蒸水加** 100ml 即配成 200mmol/L 的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶， -20℃ 保存，使用时可向 100ml 培养液中加入 1ml 谷氨酰胺溶液。
九、肝素溶液的配制：
含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高，肝素加入全培养液中**终浓度为 50ug/ml 。因为现在市售的多为肝素钠，包装为约为 0.56 克 / 瓶，配制时，可将其溶于 100ml 三蒸水中，定容，过夜，然后过滤除菌，分装小瓶，保存温度为 ℃ 。使用时，向 100ml 培养液中加入 1ml （精确可加入 0.9ml ）即可。
十、Ⅰ型胶原酶：
0.1 ％Ⅰ型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌。注意：因为 Ⅰ 型胶原酶分子颗粒比胰酶大，不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。分装入 10ml 小瓶 -20℃ 保存。#p#分页标题#e#
十一 、明胶溶液：#p#分页标题#e#
因为明胶难于过滤，所以配制 0.1 ％明胶溶液必须用无菌的 PBS 配制。所以制备过程中必须要注意无菌操作。shou要的问题是如何无菌准确称量 0.1 克 （配成 100ml 溶液） — 即解决无菌分装药品的问题。其次要注意即使是 01. 的溶液，明胶也难溶，因此要充分摇匀，过夜放置，然后无菌分装入 50ml 小瓶中， 4℃ 保存。
注意事项：
1.配制溶液时必须用新鲜的蒸馏水。
2.安装蔡式滤器时通常使用孔径 0.45 微米 和 0.22 微米滤膜各一张，放置位置为 0.45 的位于 0.22 微米的滤膜上方，并且要特别注意滤膜光面朝上。
3.配制 RPMI1640 培养基时因为还要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，为了保证培养液 PH 值**终为 7.2 ，可在配制时调 PH ** 7.4 。
细胞培养的一般过程
一、准备工作
准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，推备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行。准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，
培养箱及其他仪器的检查与调试，具体内容可参阅有关文献。
二、取材
在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的**培养称为原代培养。R
理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置 4℃的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。
由组织并分离分散细胞的方法可参阅有关文献。
三、培养
将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立即放入
培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。
正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的 PH是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示），此外对培养温度和 CO2浓度也要定时检查。
一般原代培养进入培养后有一段潜伏期（数小时到数十天不等），在潜伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分**两到三瓶继续培养。每传代一次称为“一代”。二倍体细胞一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。转化细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性（Immortality）而无恶性。
培养正在生长中的细胞是进行各种生物医学实验的良好材料。
四、冻存及复苏
为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度?－196℃，将细胞收集**冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冻存，**终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。
复苏一般采用快融方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入 37℃水中，使之在一分钟内迅速融解。然后将细胞转入培养器皿中进行培养。
冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。
细胞原代培养
一、原理
将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用 EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。 ?{uD3
二、仪器、材料及试剂
仪器：培养箱（调整** 37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）
材料：胎鼠或新生鼠
试剂：1640培养基（含 20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank’s液，碘酒
三、操作步骤
（一）胰酶消化法
1、器材：将孕鼠或新生小鼠拉颈椎致死，置 75%酒精泡 2—3秒钟（时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠带入超净台内（或将新生小鼠在超净台内）解剖取肝脏，置平皿中。
2、用 Hank’s液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。
附：Hank’s液配方：5m KH2PO4 0.06g，Nacl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖 1.0g，Na2HPO4·H2O 0.06g，加 H2O** 1000mlG1
注：Hank’s液可以高压灭菌。4℃下保存。
3、用手术剪将肝脏剪成小块（1mm2），再用 Hank’s液洗三次，转移**小青霉素瓶中。#p#分页标题#e#
4、视组织块量加入 5—6倍的 0.25%胰酶液，37℃中消化 20—40分钟，每隔 5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。#p#分页标题#e#
5、加入 3—5ml培养液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。
6、静置 5—10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。
7、1000rpm，离心 10分钟，弃上清液。
8、加入 Hank’s液 5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。
9、加入培养液 l—2 ml（视细胞量），血球计数板计数。
10、将细胞调整到 5×105/ml左右，转移** 25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。
上述消化分离的方法是**基本的方法，在该方法的基础上，可进一步分离不同细胞。细胞分离的方法各实验室不同，所采用的消化酶也不相同（如胶原酶，透明质酶等）。
（二）组织块直接培养法
自上方法第 3步后，将组织块转移到培养瓶，贴附与瓶底面。翻转瓶底朝上，将培养液加**瓶中，培养液勿接触组织块。入 37℃静置 3—5小时，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37℃继续培养。
四、注意事项
1、自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。细胞计数可在有菌环境中进行。
2、在超净台中，组织细胞、培养液等不能暴露过久，以免溶液蒸发。
3、凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。
细胞传代培养（消化法）
一、原理
细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。
传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。
二、材料和试剂
1.无菌磷酸生理缓冲液(Dulbecco’s phosphate-buffered saline, Ca++/Mg++ free, D-PBS, GibcoBRL 21600-010)
2.trypsin-EDTA solution (0.05% trypsin-0.53mM EDTA-4Na, GibcoBRL 25300-062): 以10 ml 分装于15 ml 无菌离心管中，保存于–20 ℃，使用前放在37 ℃ 水槽回温。
3.新鲜培养基
4.无菌吸管/离心管/培养瓶
三、操作步骤
（1）传代前准备：
1.预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃
水浴锅内预热。
2.用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。
3.正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。
4.点燃酒精灯：注意火焰不能太小。
5.准备好将要使用的消毒后的空培养瓶，放入微波炉内高火，8分钟再次消毒。
6.取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。
7.从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。
8.打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。
（2）胰蛋白酶消化；
1.加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以盖住细胞**好，**佳消化温度是37℃。
2.显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。
3.吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。
（3）吹打分散细胞：
1.吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。
2.吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中。
3.平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心6-8分钟。
4.弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。
（4）分装稀释细胞：
1.分装：将细胞悬液吸出分装**2-3个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。
2.显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。**后要做好标记。
（5）继续培养：用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入
CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25％时为一个＋，占50％为＋＋，占75％时为＋＋＋。
**不同类型细胞操作**
（1）附着型胞(adherent cell)
1.吸掉旧培养液。
2.用D-PBS 洗涤细胞一**二次。
3.加入trypsin-EDTA 溶液(1ml/25cm2, 2ml/75cm2)，37 ℃ 作用数分钟，于倒立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状时，吸掉trypsin-EDTA 溶 液。(若不移去trypsin-EDTA，则在 trypsin-EDTA trypsin作用后，加入适量含血清 之新鲜培养基终止作用，离心后再吸掉上清液。
4.轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，加入适量之新鲜培养基，以吸管上下吸放数次以打散细胞团块，混和均匀后，依稀释比例转移**新的培养瓶中，以正常培养条件培养。
（2）悬浮型细胞(suspension cell)
1.吸出细胞培养液，放入离心管中，离心1000 rpm 5 分钟。
2.吸掉上清液，加入适量之新鲜培养基，混和均匀后，依稀释比例转移**新的培养瓶中，以正常培养条件培养。
（3） 融合瘤(hybridoma)
有些 hybridoma cell需培养三天以上才会产生抗体，若是更换培养基，则可能会失去抗体。因此继代培养不需离心后更换培养基，直接添加新鲜培养基稀释细胞浓度即可。若体积太大，可倾斜放置，或分殖**新培养瓶中。#p#分页标题#e##p#分页标题#e#
**传代细胞培养注意事项**
1.严格的无菌操作
2.适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。
附：EDTA（0.02％乙二胺四乙酸二钠）消化液配方：
EDTA 0.20g，NaCl 8.00g， KCl 0.20g， KH2PO4 0.02g， 葡萄糖 2.00g，0.5％酚红4ml，加入蒸馏水定容**1000ml。10磅20min高压灭菌，使用时调节PH值到7.4。注意EDTA不能被血清中和，使用后培养瓶要彻底清洗，否则再培养时细胞容易脱壁。
细胞计数及活力测定
一、原理
培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。
计算细胞数目可用血球计数盘或是Coulter counter 粒子计数器自动计数。 血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber 中细刻9个1mm正方形再细刻16 个小格，深度均为0.1 mm。当chamber 上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1 mm2 x 0.1 mm=1.0 x 10-4 ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml 中之细胞数目。
在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。
存活测试之步骤为dye exclusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue 染料，如果细胞不易吸收trypan blue，则用红色之Erythrosin bluish 。
利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应，也可测定细胞相对数和相对活力。
二、仪器、用品与试剂
0.4 % w/v 台盼兰trypan blue (GibcoBRL 15250-061)
Erythosin bluish stain
取0.1 gram Erythrosin bluish (Sigma E-9259) 及0.05 gram preservative methyl paraben (Sigma H-3647) 溶于100 ml Ca++/Mg++ free saline
血球计数盘及盖玻片(Hem℃ytometer and coverslip)
计数器(counter)
低倍倒立显微镜
粒子计数器(Coulter counter, Coulter Electronics)
三、操作步骤
（一）细胞计数
3.1. 取50ml 细胞悬浮液与50ml trypan blue (or Erythrosin bluish) 等体积混合均匀于1.5ml 小离心管中。
3.2. 取少许混合液(约15ml) 自血球计数盘chamber 上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100 倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色 ( 或红色- Erythrosin bluish) 。
3.3. 计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(**少乘以2，因与trypan blue等体积混合)，**后乘以104 ，即为每ml 中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线 上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。
3.4. 若不用血球计数盘，可用Coulter counter 作自动计数，惟无法辨别死细胞或活细 胞。
然后按下式计算：
细胞数/ml＝4大格细胞总数x 2/ 4×10000
注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占 10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。
（二）细胞活力
1、将细胞悬液以 0.5ml加入试管中。
2、加入 0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色 2一 3分钟。
3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。
4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力。
死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。
活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用 。
范例：
T75 monolayer culture 制成10ml 细胞悬浮液，取0.1 ml 溶液与0.1ml trypan blue 混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之 细胞数目。
活细胞数/方格：55 ,62, 49, 59
死细胞数/方格：5, 3, 4, 6
细胞总数= 243
平均细胞数/方格= 60.75
稀释倍数= 2
细胞数/ml：60.75 x 104 x 2 = 1.22 x 106
细胞数 /flask： 1.22 x 106 x 10ml = 12.2 x 106
存活率：225/243﹦92.6 %
（三）MTT法测细胞相对数和相对活力
活细胞中的琥珀酸脱氢酶可使 MTT分解产生兰色结晶状甲赞颗粒积于细胞内和细胞周围。其量与细胞数呈正比，也与细胞活力呈正比。
l、细胞悬液以 1000rpm离心 10分钟，弃上清液。
2、沉淀加入 0.5－1ml MTT，吹打成悬液。
3、37℃下保温 2小时。
4、加入 4—5 ml酸化异丙醇（定容）。打匀。
5、1000 rpm离心，取上清液酶标仪或分光光度计 570nm比色，酸化异丙醇调零点。
注意：MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞**数。
附：
1、0.4%台盼兰染液配制：台盼兰 0.4克 加双蒸水** 100 ml。Cbeqe
2、MTT配制：MTT 0.5克，溶于 100 ml的磷酸缓冲液或无酚红的基础液中。4℃下保存。
3、酸化异丙醇配制：异丙醇中加入 HCl使**终达 0.04mol/L。
细胞的冷冻保存
1.注意事项：
1.1.欲冷冻保存之细胞应在生长良好(log phase) 且存活率高之状态，约为80 – 90 ％致密度。
1.2.冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma 应在冷冻保存前一**二日测试是否有抗体之产生。不宜将冻存细胞放置在0℃～-60℃这一温度范围内过久，低温损伤主要发生在这一温度区内，是“危险温区”。#p#分页标题#e##p#分页标题#e#
1.3.注意冷冻保护剂之品质。DMSO 应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22 micron FGLP Telflon 过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650)，以5~10 ml 小体积分装，4 ℃ 避光保存，勿作多次解冻。使用DMSO前，不需要进行高压灭菌，它本身就有灭菌的作用。高压灭菌反而会破华它的分子结构，以**于降低冷冻保护效果。在常温下，DMSO对人体有害，故在配制时**好戴上手套操作。Glycerol 亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。
1.4.冷冻保存之细胞浓度：
1.4.1.normal human fibroblast: 1~3 x 106 cells/ml
1.4.2.hybridoma: 1~3 x 106 cells/ml，细胞浓度不要太高，某些ybridoma 会因冷冻 浓度太高而在解冻24 小时后死去。
1.4.3.adherent tumor lines: 5~7 x 106，依细胞种类而异。Aden℃arcinoma 解冻后须较高之浓度，而HeLa 只需1-3 x 106 cells/ml。
1.4.4.other suspensions: 5~10 x 106 cells/ml, human lymph℃yte须**少5 x 106 cells/ml
1.5.冷冻保护剂浓度为5 或10 ％ DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup culture，以防止冷冻失败。
1.6.冷冻方法：
1.6.1.传统方法： 4℃ 10分钟--->-20℃ 30分钟---> -80℃ 16-18小时（或隔夜）--->液氮槽vapor phase 长期储存。
1.6.2. 程序降温：利用等速降温机以–1 ～ -3 ℃/分钟之速度由室温降**–120 ℃，放在液氮槽vapor phase 长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma 之保存。
2.材料
2.1.生长良好之培养细胞
2.2.新鲜培养基
2.3.DMSO (Sigma D-2650)
2.4.无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)
2.5.0.4 ％ w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)
2.6.血球计数盘与盖玻片
2.7.等速降温机(KRYO 10 Series II)
3.步骤：
3.1.冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。
3.2.配制冷冻保存溶液(使用前配制)：将DMSO 加入新鲜培养基中，**后浓度为5-10 ％，混合均匀，置于室温下待用。
3.3.依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1 ml) 计数细胞浓度及冻前存活率。
3.4.离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1-5 x 106 cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1 ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。
3.5.冷冻保存方法1: 冷冻管置于4 ℃ 10 分钟→ -20 ℃ 30 分钟→ -80 ℃ 16～18 小时(或隔夜) → 液氮槽vapor phase 长期储存。
3.6.冷冻保存方法2: 冷冻管置于已设定程序之等速降温机中，再放入液氮槽中。程序为: program 7: HB CELL
细胞活化、细胞复苏
1.收到细胞株包裹时， 请检查细胞株冷冻管是否有解冻情形， 若有请立即通知。细胞株请尽速开始培养， 或立即冷冻保存(置于–70 °C， 隔夜后， 移到liq N2)。
细胞复苏的原则－快速融化：
必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化**37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。
具体操作
一、实验前准备：
1.将
水浴锅预热**37℃
2.用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。
3.在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。
二、取出冻存管：
1.根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。
2.从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。
三、迅速解冻：
1.迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。
2.约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。
四、平衡离心：用架盘天平平衡后，放入离心机中3000r/min 离心3min
五、制备细胞悬液：
1.吸弃上清液。
2.向离心管内加入10ml培养液，吹打制成细胞悬液。
六、细胞计数：细胞浓度以5×105/ml为宜。
七、培养细胞
将复合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入37℃和5％CO2的培养箱内2-4小时（或者24-48小时）后换液继续培养培养，换液的时间由细胞情况而定。
初学者易犯错误：
1.水浴锅未预热或者未预热到37℃。
2.水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。
3.离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。
4.一次复苏细胞过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。
（另：冷冻细胞解冻程序）
2.1.依据细胞株数据单指定之基础培养基种类、血清种类和其它指定之成份和比例， 制备培养基。jue大多数之细胞均无法立即适应不同之基础培养基或不同之血清种类， 若因实验需要， 必须有所不同时， 务必以缓慢比例渐次改变培养基组成， 确定细胞适应后， 方进行所需之实验。
2.2.FBS (fetal bovine serum, 胚牛血清), CS (calf serum, 小牛血清)和HS (horse serum, 马血清)，对细胞而言差异极大，请务必依据细胞株资料单指定之血清种类培养之。
2.3.将培养基置于 37 °C水槽中回温，回温后喷以70 % 酒精并擦拭之， 移入无菌操作台内。取 出冷冻管， 立即放入37 °C 水槽中快速解冻， 水面高度不可接近或高过冷冻管之盖沿， 否则易发生污染。轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化后， 以70 % ethanol 擦拭冷冻管外部， 移入无菌操作台内。#p#分页标题#e##p#分页标题#e#
2.4.依据细胞种类和浓度，于无菌操作台内取 10 ml培养基加** T25或 T75 flask中。取出已解冻 之细胞悬浮液，缓缓加入T25 或T75 flask 内之培养基， 混 合均匀，放入37 °C，5 % CO2 培养箱培养。
2.5.对jue大多数细胞而言，1 % 以下之冷冻保护剂DMSO，不会对细胞之贴附或活化有不良影响，不需立刻由解冻细胞中去除，待第二天确定细胞生长或贴附良好后再去除即可。唯对极少数因对DMSO 敏感或会造成细胞分化之细胞，需立即去除DMSO 者， 则可将解冻后之细胞悬浮液放入5 - 10 ml 培养基中,离心300 xg (约1000 rpm)，5 分钟，小心移去上清液，加入适量新鲜培养基，将细胞均匀混合后， 转移**培养瓶中， 再放入37 °C， 5 % CO2 培养箱培养。收到T25 flask 细胞时， 处理方式为︰
（1）于寄送过程中，为避免起泡造成细胞脱落死亡，T25 flask 均加满培养基。请检查flask 外观，并于显微镜下观察细胞生长状况和有无污染现象，若有任何问题， 不要打开盖子，请立即通知细胞实验室。
（2）将原封之T25 flask 静置于37 °C， 5 % CO2 培养箱中，使细胞回温**37 °C， 并让运送过程中少数脱落的细胞可再附着生长。隔天后，于无菌操作箱内取出flask内之培养基，(取出之培养基可以再使用)，仅留约5-10ml 培养基于flask 内，依 一般培养方式再将细胞置入培养箱中或细胞已长满盘， 则将细胞做传代培养。
