传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养

一、实验目的
了解倒置显微镜的构造与使用，了解不同传代细胞的形态及接毒后的病变特征，掌握细胞的传代培养方法、病毒接种方法及收毒方法。
二、常用细胞的种类
BHK-21：仓鼠肾传代细胞
PK-15：猪肾传代细胞
IBRS-2：猪肾传代细胞
Hela：人的子宫瘤细胞
Vero：非洲绿猴肾细胞
Marc-145：来源于Vero细胞
TK-143：人的胸苷激酶阴性细胞
Sf9：昆虫细胞  
三、材料
1、100ml细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头
2、BHK-21（baby hamster kidney）细胞
3、0.25%胰酶
4、生长液：含10%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM
  维持液：含2-5%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM
5、伪狂犬病病毒液（PRV）
四、传代细胞培养的条件要求
1）细胞密度：2-3×10⁵个/ml
2）pH范围   **适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.8
3）培养温度
   哺乳动物细胞一般为37℃
   昆虫细胞28-30℃
五、常用细胞分散剂与作用原理
1、胰酶  使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解，导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。
2、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）：与二价钙、镁离子结合，从而使细胞分散。
3、灰色链丝菌酶 ：由灰色链丝菌提取的一种酶制剂，是蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶的混合物。
六、营养液
1、人工综合营养液
氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。
2、血清
1）血清的种类
    胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犊牛血清使用**为广泛。
2）血清的处理
无菌采集，过滤除菌。用前56℃灭活30min。
3）血清的作用
A、能提供细胞生存、生长和增生所必须的生长调节因子。
B、能补充基础培养液中没有或量不足的营养成分。
C、含有一些可供贴壁依赖型细胞在培养器皿表面贴附和铺展的生长基质成分。
D、有中和毒性物质保护细胞不受伤害的作用。
E、给培养液提供良好的缓冲系统。
F、提供蛋白酶抑制剂，保护细胞免受细胞释放的蛋白酶的损害。
4）应用血清存在的问题
A、血清中存在不少有害于细胞生长和繁殖的物质：补体、免疫球蛋白、生长抑制因子。
B、血清的成分不明确，影响对结果的分析。
C、不同动物、不同批次的血清成分和活性差别较大，使得培养结果不稳定。
七、传代细胞系培养
1、优点：1) 可以无限的传代。
2) 不少细胞系对病毒很敏感。
3) 某些传代细胞系能在悬浮培养条件下培养，适合病毒抗原的大量生产。
4) 生长旺盛，繁殖快速，对营养条件不苛刻。
缺点：在传代过程中遭到支原体和病毒的污染。
培养方法
1）取长满单层的细胞一瓶，倾去培养液。
2）加入2ml 胰酶消化液，于37℃培养箱放置几分钟，**细胞间出现空隙或细胞变圆后，倒去消化液。
3）加入生长液,反复吹打几次，使细胞分散成单个细胞，然后分装于3个小瓶中。再在每个小瓶中补充生长液**10ml，然后置37℃培养箱培养，培养1-2天即可长成单层。
八、病毒（PRV）在传代细胞中的培养
1、选长满单层的细胞，倒掉培养液。
2、加入适量的病毒悬液
3、置温箱中感作（吸附）45min-1h。
4、取出瓶子，倒掉或不倒掉培养液，补足维持液，置温箱中继续培养，直**80%以上的细胞病变。
5、收毒：将病变的细胞置于-20℃冰箱中，冻结后取出自然解冻，在解冻过程中振摇几次，以使细胞完全从瓶壁上脱落。然后将病毒液收集于盐水瓶或其它容器中。低温贮藏备用。
 
实验四  病毒感染力的滴定（TCID₅₀的测定）
一、实验目的
    了解病毒感染力测定的几种常用方法，掌握半数细胞培养物感染量TCID₅₀的操作步骤、计算方法及含义。
二、测定病毒感染力的方法
半数致死量LD₅₀( 50% lethal dose)：用动物或鸡胚来检测
半数鸡胚感染量EID₅₀(egg 50% infective dose)：用鸡胚来检测
半数细胞培养物感染量TCID₅₀（50% tissue culture infective dose)：用细胞来检测
蚀斑形成单位（plaque forming unit，PFU）：用细胞来检测
三、材料 
1、长满单层的细胞1瓶
2、胰酶、吸球、吸管、生长液
3、96孔细胞培养板
4、加样器、枪头
5、病毒液（PRV）
四、TCID₅₀的操作步骤
1、在青霉素瓶或离心管中将病毒液作连续10倍的稀释，从10^-1-10^-10。
2、将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度接种一纵排共8 孔，每孔接种100µl。
3、在每孔加入细胞悬液100µl，使细胞量达到2~3×10⁵个/ml。
4、设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。（100µl生长液+100µl细胞悬液）#p#分页标题#e##p#分页标题#e#
5、逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。
6、结果的计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法
五、TCID₅₀的计算方法
1、Reed-Muench两氏法

病毒液稀释度	出现CPE孔数	无CPE孔数	累    计		出现CPE孔所占的%
			CPE孔数	无CPE孔数
10-1	8	0	27	0	100（27/27）
10-2	8	0	19	0	100（19/19）
10-3	7	1	11	1	91.6 （11/12）
10-4	3	5	4	6	40（4/10）
10-5	1	7	1	13	0.7（1/14）
10-6	0	8	0	21	0（0/21）

CPE：Cytopathic effect
距离比例＝（高于50%病变率的百分数-50%）/（高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数）
        ＝（91.6-50）/（91.6-40）
       ＝ 0.8
lgTCID₅₀=距离比例×稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数
       =0.8×(-1)+(-3)
       =-3.8
TCID₅₀=10^-3.8/0.1ml
含义：将该病毒稀释10^3.8接种100µl可使50%的细胞发生病变。
2、Karber法

病毒液稀释度	出现CPE的孔数	出现CPE孔的比率
10-1	8	8/8=1
10-2	8	8/8=1
10-3	7	7/8=0.875
10-4	3	3/8=0.375
10-5	1	1/8=0.125
10-6	0	0/8=0

 
lgTCID₅₀=L-d(s-0.5)
L：**高稀释度的对数
D：稀释度对数之间的差
S：阳性孔比率总和
lgTCID₅₀=-1-1×(3.375-0.5)
       =-3.875
TCID₅₀=10^-3.875/0.1ml
含义：将该病毒稀释10^3.875接种100µl可使50%的细胞发生病变。
 
  
Marc 145细胞培养和维持综述 
发布: 2010-02-10 来自: 易生物实验 阅读数：5241次 
一、 细胞及培养
1、Marc145细胞
上皮样细胞，来源于猴肾细胞，从母细胞（MA 104细胞）克隆而得到，可连续培养。
2、生长培养基
DMEM（高糖型，含4500mg/L D－葡萄糖、L-谷氨酰胺，和110mg/L丙酮酸钠，不含碳酸氢钠）＋5－10％新生牛血清+ 1%双抗（青霉素和链霉素）的培养液。
3、冻存液
生长培养基＋10% DMSO
4、细胞健康生长的几项注意事项
（1）细胞没有支原体等外源因子的感染。
（2）培养液的pH值可在7.0－7.3，以7.2为佳。#p#分页标题#e#
（3）一般按1：3传代，细胞接种密度为1－1.5×105cells/ml，48hr后长成单层。#p#分页标题#e#
（4）培养基和血清的质量可靠、稳定；建议采用特级小牛血清。
（5）细胞及时传代，不可以在老化后传代，一般在刚长成细胞单层时进行传代、扩增。
（6）细胞传代时消化液用0.25%胰蛋白酶+0.03%EDTA，消化过程应尽量缩短在1～2分钟内完成。
二、 病毒感染、维持和收获
转瓶中细胞长成单层后，弃瓶内细胞生长液，接种PRRS病毒。37℃吸附1hr，加入维持液，置37℃恒温室转瓶机上旋转培养3－5天。
维持液：DMEM+4～5％新生牛血清。
pH应为7.4～7.8；后期维持pH会慢慢降下来。
细胞病变时间出现在接毒后48小时，72～96小时细胞病变达80％左右，当细胞出现80%以上病变（CPE）时，即可开始收毒；反复传过几代后病变时间可缩短。
第3、4天注意观察，细胞病变（CPE）达到80％时收获病毒，－20℃冻融3次，混匀病毒悬液，96孔板测定TCID50。
收液时需要将含毒细胞反复冻融2～3次以破碎细胞，将病毒释放到培养液中。
三、 细胞病变（CPE）
细胞在接种病毒后，24－48hr开始出现病变，72－96hr约达到80％病变。病变现象：细胞空泡化、圆缩、先灶状脱落，再大片脱落，**后整个细胞裂解、破碎。图1是指PRRSV感染后，出现细胞病变的Marc 145细胞。
四、 PRRS病毒在细胞中增殖规律（ Virology Journal, 2006, 3: 90）
PRRS病毒感染Marc 145细胞过程可大致分为两个感染阶段，**阶段：病毒感染细胞后的20－22hr左右，仅部分细胞被随机感染，而且Marc 145细胞对PRRS病毒的低感染性（low permissiveness）与MOI量无关，因为MOI剂量比常规量提高100倍，感染22hr后，仍仅5.5%的细胞呈PRRSV阳性（PRRSV-positive）。第二阶段：感染后的2－3天（也称为病毒的对数感染期），病毒感染蔓延是通过相邻细胞和细胞之间的接触感染，细胞对自由病毒不敏感（Cells is nonpermissive to free Virus），并出现了感染细胞群。 感染过程如图5所示。
对我们的一点启示：可以采用适当低量的MOI进行病毒感染，比如0.05virus/cell；同时，大部分细胞在维持期的**天尚需继续生长，而且病毒在2－4天才是感染、增殖的高峰，较长的病毒维持期均需要供给丰富的营养物资，可以相信：维持液的营养成分对病毒增殖效率有非常重要的影响
细胞的复苏
一、细胞复苏的原则
在实际操作中，冻存细胞要进行复苏，再培养传代。复苏细胞一般采用快速融化法。以保证细胞外结晶快速融化，以避免慢速融化水分渗入细胞内，再次形成胞内结晶损伤细胞。
二、细胞复苏的主要操作步骤
(1)佩戴眼镜和手套，从液氮罐中取出安瓿或冷冻管。
(2)迅速放入38℃水浴中，并不时摇动，在1分钟内使其完全融化，然后在无菌下取出细胞。
(3)在1000r/min速度下离心5～10分钟，弃去上层液，加入适量培养液后接种于培养瓶中，接种浓度1×109/L，置37℃温箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养，观察生长情况。若细胞密度较高，及时传代。或无需离心直接将细胞加入瓶中，并加入培养基贴壁培养12～24小时后，充去上清，换入新鲜培养基继续培养。
三、注意事项
在细胞复苏操作时，应注意融化冻存细胞速度要快，可不时摇动安瓿或冷冻管，使之尽快通过**易受损的温度段(-5～0℃)。这样复苏的冻存细胞存活率高，生长及形态良好。然而，由于冻存的细胞还受其他因素的影响，有时也会有部分细胞死亡。此时，可将不贴壁、飘浮在培养液上(已死亡)的细胞轻轻倒掉，再补以适量的新培养液，也会获得较为满意的结果。