细胞培养程序

材料

A、仪器
1. 净化工作台，2. 离心机，3. 恒温水浴箱，4. 冰箱（4℃）
5. 倒置相差显微镜，6. CO2培养箱，7. 振荡混合仪
8. 酶联免疫检测仪，9. 移液枪，10. 电磁力搅拌机，11. 微孔滤器
B、玻璃器皿
1. 吸管，2. 小烧杯（100ml），3. 废液缸，
C、塑料器皿
1. 吸头，2. 枪头，3. 96孔培养板，4. 15ml离心管，
5. 50ml离心管，6. 胶塞，
D、其他物品
1. 微量加样枪，2. 红血球计数板，
F、试剂
1. D-Hanks液，2. 小牛血清，3. RPMI1640，
4. 双抗（青霉素、链霉素），5. 0.25%胰酶，6.0.025%  EDTA
7. 二甲基亚砜（DMSO），
8. MTT溶液：称取250mgMTT，放入小烧杯中，加50ml培养液或平衡盐溶液在电磁力搅拌机上搅拌30min，用0.22um的微孔滤器除菌，分装，4℃保存备用，两周内有效。
一、原代细胞培养或细胞株（系）复苏培养：
（一）细胞原代培养
1.贴壁细胞培养法：
1）、组织块培养法  
将所取得的组织用含青霉素、链霉素400U/ml和400ug/ml的生理盐水漂洗2此，5分钟/次。取出组织尽可能的取出液滴，置青霉素小瓶中，加两滴小牛血清，用剪刀尽可能将其剪碎，用吸管将其泥状的组织点种在培养瓶壁，倒置于37°、5%CO2条件下30分钟后将培养瓶正置，从培养瓶的一端缓缓加入完全培养液（小牛血清15%、青霉素、链霉素各100U、100ug/ml），使组织块有培养液与其接触为准，轻轻放置于37°培养。待24小时候补液。
或小块放置后,轻轻翻转培养瓶,使瓶底朝上,然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞,将瓶倾斜放置在37℃温箱内。 培养2~4小时，待小块贴附后，将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养，动作要轻，严禁摇动和来回振荡，以防由于冲动而使小块漂起而造成培养失败，若组织块不易贴壁可预先在瓶壁涂一薄层血清、胎汁或鼠尾胶原等。开始培养时培养基不宜多，以保持组织块湿润即可，培养24小时后再补液，培养3~5天时可换液，一方面补充营养，一方面去除代谢产物和漂浮小块所产生的毒性作用。
其他方法：消化分离法  、器官培养  略
2.悬浮细胞培养法  
对于悬浮生长的细胞，如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化，可采用低速离心分离，直接培养，或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。  
（二）细胞株(系)细胞复苏培养
细胞复苏的主要操作步骤
(1)佩戴眼镜和手套，从液氮罐中取出安瓿或冷冻管。
(2)迅速放入38℃水浴中，并不时摇动，在1分钟内使其完全融化。
(3) 然后在无菌下取出细胞。冻存管用75%酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管将细胞悬液注入离心管中，再滴加10ml培养液。
(4)在1000r/min速度下离心5～10分钟，弃去上层液，加入适量培养液后接种于培养瓶中，接种浓度1×109/L，置37℃温箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养，观察生长情况。若细胞密度较高，及时传代。或无需离心直接将细胞加入瓶中，并加入培养基贴壁培养12～24小时后，充去上清，换入新鲜培养基继续培养。加入的培养液的量依冻存的细胞数量，如果冻存数量为10⁶，则稀释10倍使细胞达到10⁵即可。
注意事项
在细胞复苏操作时，应注意融化冻存细胞速度要快，可不时摇动安瓿或冷冻管，使之尽快通过**易受损的温度段(-5～0℃)。这样复苏的冻存细胞存活率高，生长及形态良好。然而，由于冻存的细胞还受其他因素的影响，有时也会有部分细胞死亡。此时，可将不贴壁、飘浮在培养液上(已死亡)的细胞轻轻倒掉，再补以适量的新培养液，也会获得较为满意的结果。
二、细胞维持培养（细胞换液培养）、培养选拔常规观察
 (一)原代细胞的维持
1、贴壁细胞（包括半贴壁细胞的换液）  
一般三天后组织块周围即可见梭形细胞长出。第三天换液一次，其换液方法比较简单，即弃去旧液，加入与原培养液相同的等量完全培养基。若希望细胞能在较长时间内能维持存活，但不需增殖，此时要换成含2%小牛血清的维持液。  待不同组织块周围的细胞连接成片时即可传代。
2、悬浮细胞  
凡经培养后只在细胞培养基中悬浮生长而不贴壁的细胞，需在倒置显微镜下方可观察到细胞的形态和生长现象，淋巴细胞的短期培养无需换液，但加入生长因子或有丝分裂源（PHA、PMA、COnA、PWM、LPS等）后，细胞不仅会发生转化而且会发生分裂繁殖，此时培养基中的营养成分并不能维持细胞的营养需求，加之代谢产物增多，pH变酸，细胞不适宜生长，需进行换液。白血病细胞或淋巴瘤细胞体外长期培养时，都需换液培养，待达到饱和密度时才能传代。换液时，只能采用半量换液的方式，千万不能采取倒去旧液加入新液的方式进行换液。
半量换液的方法如下：  
将原培养瓶竖起，在30分钟内，若细胞沉于瓶底，可用吸管轻轻吸去一半上清弃去，再加入等量的新鲜完全培养基。若细胞不能沉于瓶底，可吸出细胞悬液，采用低速离心（1000r/min 10min）弃去一半上清加入等量的新鲜完全培养基，混匀后再转入原瓶继续培养。  
（二）传代细胞维持培养：同上
（三）培养选拔常规观察：#p#分页标题#e##p#分页标题#e#
1.培养液
2.细胞生长情况
3.细胞形态变化
4.污染情况
三、细胞的传代培养：
(1)弃旧培养液：吸除或倒掉原瓶中的旧培养基（以25mL培养瓶为例）。  
(2)漂洗：每瓶加入2mL，无钙、镁PBS或HANKS液，漂洗贴壁细胞一次后倒掉。  （此步可以省略） 
(3)消化：每瓶加入1mL消化液（0.25%胰蛋白酶或0.025EDTA混合液1:1），轻轻摇动培养瓶，经消化液铺满所有细胞表面，在倒置显微镜下待1/2细胞变园后加适量完全培养液终止。或细胞层略有松动，肉眼可观察到“薄膜”现象时，倒掉消化液，再继续作用2～3分钟，轻轻摇动，细胞层可随残留的消化液呈片状从瓶壁上脱落下来，在显微镜下可发现细胞回缩变圆，细胞间隙增大，此时应立即终止消化）。在37°或25°以上环境进行消化。
 (4)终止：加入完全培养基适量（通常10-20%胎牛血清培养基）5ml，用吸管反复吹打瓶壁上的细胞，吹打时要按顺序进行，以确保所有瓶壁均吹打到，吹打时动作要轻柔，不要用力过大，尽可能不要出现泡沫，以避免细胞的机械损伤。  
(5)离心：离心（1100rpm）沉淀细胞（5-10分钟），去除培养基（含胰酶及EDTA）。
(6)计数：离心前先滴好计数板待计数，计算细胞的浓度。
(7)传代或冻存：离心后用完全培养基调整适当的细胞浓度后再分瓶培养（可1:3**1:5传代，在25cm2的培养瓶中长满细胞可达5*10⁶/ml，经10倍稀释每瓶达10⁵/ml即可，25cm2的培养瓶每瓶5ml培养液）。或用冻存液调整浓度（一般达1*10⁷）冻存。（ 到此步时经证实未被细菌或真菌污染，则撤去抗生素，以免对细胞的生长长生不利影响，指原代培养细胞）
四．细胞冻存： 
细胞冻存液：
20%  小牛血清
10%  二甲基亚砜DMSO
70%  培养液
操作步骤：
1. 选对数增生期细胞（证明无支原体污染），在冻存前**换液。
2. 按常规方法把培养细胞制成悬液，计数，使细胞密度达5*10⁷/ml左右，离心，去上清液。（冻存细胞数量要充分，密度达5*10⁷/ml，在溶后稀释20倍时，仍能保持5*10⁵ml数量）。一般25cm²的培养瓶满瓶才达到10⁵.
3. 加入配置好的冻存液，与去上清液相同的量一滴一滴的加入离心管中，让侯用吸管轻轻吹打令细胞重悬。冻存细胞室培养液中加入保护剂10%二甲亚砜(DMSO)或甘油，可使冰点降低，使细胞内水份在冻结前透出细胞外。（细胞冷冻保存时**常使用的冷冻培养基是含5-10%DMSP和90-95%原来的细胞生长用之新鲜培养基均匀混合。注意由于DMSO稀释时会释放出大量热能，故不可将DMSO直接加入细胞液中，必须使用前先行配制完成）
4. 分装于无菌冻存管中，每管1.5ml悬液。
5. 旋好冻存管并仔细检查，一定要盖紧，做好标志。
6. 冻存：
1） 冰箱4℃放2小时，-75℃过夜，转液氮保存，
2） 4°，0°，-20°各30分钟（现代分子生物学实验技术P647），**后直接放入液氮中保存或-80°冰箱保存。

附件一、培养细胞的生长状况观察

（一）细胞计数操作规程

胎盘蓝法原理：（产品批号：T8154，T6146和Z35,962－9）
使用胎盘蓝染色决定血细胞总数和活细胞数目，胎盘蓝是用于染色的多种染料中能被活细胞排斥的一种染料，这种方法的成立是基于活细胞不能被染色：胎盘蓝对血清蛋白比细胞蛋白有一种更强的亲和力，如果背景太深，在计数之前细胞应成球状并重悬在无蛋白的培养基或盐液中。
方法：
1、预先在平衡盐液中悬浮细胞（例如：Hank’s平稳盐液HBSS，产品批号：H2513）
2、取0.5ml　0.4%胎盘蓝于一试管中，加0.3ml（HBSS和0.2ml细胞悬液（稀释倍数＝5）并且混匀，允许放置5－15分钟。
注意：如果细胞在胎盘蓝中暴露时间过长，活细胞也会像死细胞一样被染上色。
3、在血细胞计数板上盖上盖玻片，使用巴斯德毛细吸管或其它合适的器材取少量的胎盘蓝细胞悬液于血细胞计数板上的两个小室中。将巴斯德毛细吸管小心的靠在盖玻片边缘，利用毛细张力充满小室，不要过度或过少充盈。
1）从血细胞计数板的一个小室开始，计数中间和四角边长/mm的正方形中的所有细胞数（详见sigmaP1845的图样I）死细胞被染成蓝色，分别计数活细胞和死细胞数。
注意：压线细胞的计数原则，数上不数下，数左不数右（详见sigmaP1845的图II）
2）重复上述步骤计数第2个小室
注意：如果超过10%的细胞成串，应重复全部程序通过吹打务必使细胞在原液中和在胎盘蓝细胞悬液中一样分散，如果在10个正方形方格中细胞数少于200个或多于500个（20－50个细胞/正方形）应重复这个步骤，以调节细胞稀释倍数。
3）准备第二份样品并重新计数以保证准确
4）细胞计数－血细胞计数板上盖好盖玻片的每个正方形（指中央大方格，其长度宽度均为1mm的正方形，与盖玻片的距离为0.1mm），总体积为0.1mm³或10^-4cm³。若1cm³近仍等于1ml，那么每毫升中集中的细胞数（和细胞总数）则可以这样来计算。
每毫升细胞数＝每个正方形的平均细胞数´稀释倍数´10⁴（10个正方形的细胞计数）#p#分页标题#e##p#分页标题#e#
例：如果每个正方形的平均细胞数是45´5´10⁴＝2.25´10⁶个细胞/ml
总细胞数＝每毫升细胞数´**初的细胞样品的体积
例：2.25´10⁶ (个细胞/ml) ´10ml（**初体积）＝2.25´10⁷个细胞（总细胞）
5）活细胞比例（%）＝总的活细胞数（没染上色的）¸总的细胞（染上色的和没染上色的）´100
例：如果每个正方形中没染上色的（活的）细胞平均数是37.5，总活细胞数＝(37.5´5´10⁴)活细胞数/ml´10ml（**初体积）＝1.875´10⁷个活细胞，活细胞比率（%）＝1.875´10⁷（活细胞数）¸2.25´10⁷(总细胞数) ´100＝83%.
血球计数板的使用
16×25型的计数板  将计数室放大，可见它含16中格，一般取四角：1、4、13、16四个中方格（100个小方格）计数（见图二）。将每一中格放大，可见25个小格。计数重复3次，取其平均值。计数完毕后，依下列公式计算：
酵母细胞个数／1mL=100个小方格细胞总数/ 100 ×400×10000×稀释倍数或：4个中格的细胞数/4×16×10000×稀释倍数
 
 有一种计数板的结构为25×16，计算如下：4个中格的细胞数/4×25×10000×稀释倍数
（二）.细胞生长曲线（细胞贴壁率、细胞分裂率：略）
概念：
细胞生长曲线是测定细胞**生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标，是培养细胞生物学特性的基本参数之一。一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮然后贴壁，随后度过长短不同的潜伏期，即进入大量分裂的指数生长期。在细胞达到饱和密度后，停止生长，进入平顶期，然后退化衰亡。为了准确描述整个过程中细胞数目的动态变化，典型的生长曲线可分为生长缓慢的潜伏期，斜率较大的指数生长期，呈平台状的平顶期及退化衰亡4个部分。以存活细胞数(万／mL)对培养时间(h或d)作图，即得生长曲线。
方法：
计数法：
1．取生长良好接近汇合的细胞，用胰酶消化，用新培养基制成细胞悬液后计数(见四、细胞传代培养的实验步骤)。如是非粘壁细胞，则离心弃旧培养基后，换上一定量的新鲜培养基然后制成细胞悬液计数。
2．根据细胞计数结果按每个小方瓶5×104／mL作传代培养接种细胞，共接种21瓶细胞。
3．24 h后开始计数细胞，以后每隔24 h计数一次，每次取3瓶细胞，分别进行计数。计算平均值。连续计数7 d。 　　
4．根据细胞计数结果，以单位细胞数(细胞数／mL)为纵坐标，以时间为横坐标绘制生长曲线。
MTT法：　　
1．制备1 mL细胞悬液。空白对照以1 mL培养基代替细胞悬液。加入0．1 mL MTT于37℃孵育4 h。使MTT还原为蓝紫色甲月赞结晶。 　　
2．加1 mL DTW脱色液，37℃**少静置30 min(甚**过液)，使甲质颗粒充分溶解。 　　
3．吸取200 μL该溶解液**96孔板孔中，在酶标仪上读取OD值，检测波长570 nm，参考波长630 nm。
4．每隔24 h测量一个点，每个点为3个平行样品的平均值。
CCK-8法：略
CCK-8法的优点： 1、使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂； 2、CCK-8法能快速检测； 3、CK-8法的检测灵敏度很高，甚**可以测定较低细胞密度； 4、CCK-8法的重复性优于MTT法； 5、CCK-8法对细胞毒性小； 6、CCK-8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。 
 CCK-8法的缺点: 1、与MTT法相比，CCK-8和XTT的价格比较贵。 2、CCK-8试剂的颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，不注意的话容易产生漏加或多加。
（三）.活选细胞观察：相差倒置显微镜使用：略
附件二：
细胞裂解液：提取RNA用
0.5%   SDS
0.1mmol/L  EDTA(PH8.0)
10 mmol/L Tris.cl(PH8.0)
20 ug/ml  RNase
TE:RNA、DNA溶解用
1mmol/L EDTA(PH8.0)
10 mmol/L Tris.cl(PH8.0)
附件三.IC50半抑制率实验：
MTT法：
MTT原理、步骤、结果分析方法及注意事项：MTT全称为3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。
MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。
　　缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。
MTT 溶液的配制方法
　　通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃ 避光保存即可。在配制和保存的过程中，容器**好用铝箔纸包住。需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞**数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度**好在0-0.7 范围内。#p#分页标题#e##p#分页标题#e#
　　MTT一般**好现用现配，过滤后4ºC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，**好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就**不能再用了。
　　MTT有致癌性，用的时候小心,有条件**好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉.配制MTT时用用PBS溶解,也有人用生理盐水配，60℃水浴助溶。
PBS配方：
　　Nacl 8g
　　Kcl 0.2g
Na2HPO4 1.44g
　　KH2PO4 0.24g　
　　调pH 7.4
　　定容1L
MTT法实验步骤
贴壁细胞：
　　1、收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度**1000-10000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。
　　2.、5%CO2，37℃孵育，**细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前**下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况
　　3.、5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
　　4、每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。
　　5、终止培养，小心吸去孔内培养液。
　　6、每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
　　7、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）
　　悬浮细胞：
　　1、收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml，按次序将①补足的1640（无血清）培养基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培养液稀释 (储存液100mg/ml，需预试寻找**佳稀释度，1:10-1:20)；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加100ml 1640）。
　　2、置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
　　3、每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值）
　　4、离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。
　　5、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。
注意事项：
（1）选择适当得细胞接种浓度。
（2）避免血清干扰：一般选小于10％的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。
（3）设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，**后比色以空白调零。
（4）MTT实验吸光度**后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系，
IC50是半抑制率：
一定浓度的某种药物诱导肿瘤细胞凋亡50%，该浓度称为50%抑制浓度. IC50值可以用来衡量药物诱导凋亡的能力，即诱导能力越强，该数值越低,当然也可以反向说明某种细胞对药物的耐受程度。意思是抑制率50％的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度，然后计算各自的抑制率，以药品的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，然后得到50％抑制率时候的药品浓度，就是IC50。要点：药品2倍稀释，多做梯度，做点线图即可！
举个例子：各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀释倍数为10，**大浓度为0.1，抑制率为0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入 计算公式：Pm=0.95，Pn=0.06，P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1
Xm=lg0.1=-1，lgI=lg0.1/0.01=1，lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025
IC50=0.00025
有一个公式可供参考;
lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)
Xm:lg **大剂量
I:lg(**大剂量/相临剂量)
P:阳性反应率之和
Pm:**大阳性反应率
Pn:**小阳性反应率
抑制率=1-加药组OD值/对照组OD值
公式中的**大**小阳性反应率就是**大**小抑制率
例：
用96孔板培养SMMC-7721肝癌做MTT测细胞活力,应该加多少1640培养基,多少MTT和DMSO合适?根据书上说的加200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO 加DMSO之前要尽量去掉培养液，便于DMSO溶解甲臜颗粒进行比色测定
一般每孔4000个细胞为宜，既细胞浓度在20000个/ml，MTT加20ul，作用四小时后洗掉上清液，注意不要将甲瓉洗掉，然后每孔加150ul DMSO，在脱色摇床上振荡10分钟，然后测吸光值。
一般要低于IC50，避免非调亡性杀伤的细胞太多，造成流式细胞仪检测碎片太多。我一般用1/2-1/3的IC50，作用时间为36h。一般肿瘤细胞系空白处理的调亡率应低于1%，用药后一般为5-10%（Annexin V），细胞周期的亚G0峰比较明显。