肿瘤细胞培养实验报告

(一) 实验目的、?
1) 学习细胞传代知识
2) 掌握细胞传代
3) 进行细胞传代

(二) 方法与材料、
8 s# [& n3 i7 }5 d, R; u1. 所用细胞：卵巢癌细胞HO-8910 HO-8910PM 4 Y, z8 k/
2. 试剂：0.25％胰酶、1640培养基（含10％小牛血清） ) e1 C1
3. 仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、培养瓶、吸管、废液缸等

(三) 步骤、
1. 吸除培养瓶内旧培养液。
2. 向瓶内加入胰蛋白酶和EDTA混合液少许，以能覆满瓶底为限。
3. 置温箱中2~5分钟，当发现细胞质回缩，细胞间隙增大后，立即终止消化。
4. 吸除消化液，向瓶内注入培养液数毫升，轻轻转动培养瓶，把残余消化液冲掉。注意加培养液冲洗细胞时，动作要轻，以免把已松动的细胞冲掉流失。
5. 用吸管吸取营养液轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液。
6. 把细胞悬液吸取部分装入新培养瓶中，置温箱中培养。
细胞培养的一般过程
准备工作
　　准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试等;
取材;
在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。机体取出的组织细胞的**培养称为原代培养。理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置4℃的培养液中保存。取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。
培养%
将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。
正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的PH 是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示），此外对培养温度和CO2 浓度也要定时检查。
一般原代培养进入培养后有一段潜伏期（数小时到数十天不等），在潜伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分**两到三瓶继续培养。每传代一次称为“一代”。二倍体细胞一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。转化细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性（Immortality）而无恶性。培养正在生长中的细胞是进行各种生物医学实验的良好材料。
冻存及复苏;
为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般用液氮的温度－196℃，将细胞收集**冻存管中加入含保护剂（一般为二甲亚砜或甘油）的培养基，以一定的冷却速度冻存，**终保存于液氮中。在极低的温度下，细胞保存的时间几乎是无限的。
复苏一般采用快融方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37℃水中，使之在一分钟内迅速融解。然后将细胞转入培养器皿中进行培养。
冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。

(四) 结果、
细胞传代培养照片如下：