VERO细胞培养、纯化灭活的狂犬病毒

  细胞培养知识

VERO细胞培养、纯化灭活的狂犬病毒

vero细胞 
　　Vero细胞被成功的用来培养狂犬病疫苗、乙脑疫苗等多种疫苗，在非典期间又为研究冠状病毒做出贡献，在医药研究种广泛应用。
来源： 非洲绿猴肾细胞 形态：上皮细胞 生长特性：贴壁
注释：该细胞是日本千叶大学的Y. Yasumura和Y. Kawakita于1962年3月27日从一只正常的成年非洲绿猴肾组织培养出来的。
培养液：MEM（ 含 2 mM L-谷氨酰胺 和 Earle's BSS，1.5 g/L NaHCO3, 0.1 mM 非必需氨基酸, 1.0 mM 丙酮酸钠）， 10%胎牛血清
传代：吸去培养液。 用 0.25% (w/v) Trypsin- 0.53 mM EDTA洗一次，以去除血清（血清会抑制胰酶的活性）。 加2-3毫升Trypsin-EDTA，放在37℃培养箱内约5分钟，直到细胞全部脱落。 加6-8毫升培养液，用移液器把细胞吹散。 加适量的细胞到新的培养器皿中。（以1:3**1:6为宜，传代期间培养液每周更换2-3次）
冻存： 95%培养液+5%DMSO冻存于液氮。
CHO-K1细胞 
 
 
 
　
　CHO-K1细胞是实验中非常常用的一个细胞株，在生物制药中使用也非常广泛。该细胞株培养条件简单，贴壁强度适中，比较容易转染，很适合用它来研究一般哺乳动物基因的功能。
来源：Cricetulus griseus (中G仓鼠) 卵巢 形态：表皮细胞 生长特性：贴壁
注释：CHO-K1由CHO衍生而来，CHO是T. T. Puck 在1957年从一只成年中G仓鼠卵巢获得的（1）。
培养液：Ham's F12K （含2 mM L-谷氨酰胺，1.5 g/L NaHCO3）， 10% 胎牛血清。
传代：吸去培养液。 用0.25% (w/v) Trypsin- 0.53 mM EDTA洗一次，以去除血清（血清会抑制胰酶的活性）。 加2-3毫升Trypsin-EDTA，放在37℃培养箱内约5分钟，直到细胞全部脱落。 加6-8毫升培养液，用移液器把细胞吹散。 加适量的细胞到新的培养器皿中。（以1：4到1：8为宜，传代期间培养液更换1-2次）
冻存：95%培养液+5%DMSO冻存于液氮。
1. Puck TT , et al. Genetics of somatic mammalian cells III. Long-term cultivation of euploid cells from human and animal subjects. J. Exp. Med. 108: 945-956, 1958. PubMed: 13598821
293细胞
　　
 
 
 
293细胞比较容易转染，是一个很常用的表达研究外源基因的细胞株。293细胞的一个衍生株：293T/17的转染效率更高，成为广大研究者研究基因功能的一个强大工具。
　　293细胞的缺陷是生长过程中贴壁强度比较小。所以在实验过程中容易流失，从而影响实验结果。如果一个实验室新得到的293细胞是邮寄得到的并且细胞在培养瓶中，就需要让细胞沉降几天时间，因为大量细胞会漂浮在培养液里。
来源：人体肾脏 形态：上皮细胞 生长特性：贴壁 注释：该细胞含腺病毒5 DNA 。
培养液： MEM（ 含 2 mM L-谷氨酰胺 和 Earle's BSS，1.5 g/L NaHCO3, 0.1 mM 非必需氨基酸, 1.0 mM 丙酮酸钠）， 10% 马血清（热灭活）。
传代： 吸去培养液。 用0.25% (w/v) Trypsin- 0.53 mM EDTA洗一次，以去除血清（血清会抑制胰酶的活性）。 加2-3毫升Trypsin-EDTA，放在37℃培养箱内约5分钟，直到细胞全部脱落。 加6-8毫升培养液，用移液器把细胞吹散。 加适量的细胞到新的培养器皿中。（以1：2到1：4为宜，传代期间培养液2-3天更换1次）
冻存：95%培养液+5%DMSO冻存于液氮。
NIH-3T3细胞
　
 
 
　NIH-3T3细胞在实验室常用来做转染及基因表达的研究。易感病毒有鼠肉瘤病毒和鼠白血病毒。
来源： Mus musculus（小家鼠）胚胎 形态：成纤维细胞样 生长特性：贴壁
注释：为得到适合转染得细胞株，NIH-3T3细胞**少连续克隆过5次。NIH-3T3细胞容易转染DNA，鼠痘病毒阴性。
培养液：DMEM（含4mM L-谷氨酰胺、4.5g/L葡萄糖、1.5g/L碳酸氢钠），10%小牛血清
传代：吸去培养液。（不要让细胞长满培养器皿，长满80%为宜） 用 0.25% (w/v) Trypsin- 0.53 mM EDTA洗一次，以去除血清（血清会抑制胰酶的活性）。 加2-3毫升Trypsin-EDTA，放在37℃培养箱内约5分钟，直到细胞全部脱落。 加6-8毫升培养液，用移液器把细胞吹散。 加适量的细胞到新的培养器皿中。（以3-5x103/cm2为宜，传代期间培养液每周更换2次）
冻存： 95%培养液+5%DMSO冻存于液氮。
PC-12细胞 
PC-12细胞是一个常用的神经细胞株。
来源： Rattus norvegicus (褐家鼠) 肾上腺嗜铬细胞瘤（一种交感神经系统的肿瘤）
形态：多角型细胞 生长特性：贴壁较松，容易成团
注释：PC-12细胞株来源于一种可移植的鼠嗜铬细胞瘤，该细胞对神经生长因子（NGF）有可逆的神经元显形反应，该细胞不合成肾上腺素。#p#分页标题#e##p#分页标题#e#
培养液：Ham's F12K （含2 mM L-谷氨酰胺，1.5 g/L NaHCO3）+15%马血清+2.5% 胎牛血清。
传代：吸去培养液。 加入新的培养液，用吸管吹下细胞或用手拍打培养瓶或刮下细胞到培养液中，用移液器把细胞吹散。 加适量的细胞到新的培养器皿中。（以1：4为宜，传代期间2-3天更换培养液）
冻存：95%培养液+5%DMSO冻存于液氮。
Hela细胞 
　
 
 
　Hela细胞是在所有细胞株中****的。它来源于美G的Helen Lane，她1951年死于子宫颈癌。但源自她的肿瘤的细胞却在世界各地的实验室中得到广泛的使用。
来源：人宫颈癌 形态：上皮细胞 生长特性：贴壁
注释：Hela细胞显角蛋白免疫沉淀染色阳性，包含HPV-18序列，有正常水平的pRB和p53的低水平表达。
培养液：MEM（ 含 2 mM L-谷氨酰胺 和 Earle's BSS，1.5 g/L NaHCO3, 0.1 mM 非必需氨基酸, 1.0 mM 丙酮酸钠）， 10%胎牛血清
传代：吸去培养液。 用0.25%（w/v）Trypsin-0.53 mM EDTA洗一次，以去除血清（血清会抑制胰酶活性）。 加2-3毫升Trypein-EDTA，放37℃培养箱内约5分钟，直到细胞全部脱落。 加6-8毫升培养液，用移液器把细胞吹散。 加适量的细胞到新的培养器皿中。（以1：2到1：6为宜，每周传代2-3次）
冻存：95%培养液+5%DMSO冻存于液氮。
Sf9细胞 
　　Sf9细胞常在Baculovirus（杆状病毒）表达系统中用作宿主细胞，来表达外源蛋白。
来源： Spodoptera frugiperda （草地夜蛾）卵巢细胞 形态：上皮细胞 生长特性：贴壁
注释：Sf-9细胞是由G.E. Smith 和 C.L. Cherry 在1983年从细胞株IPLB-SF 21 AE得来的一个克隆。IPLB-SF 21 AE是1977年由Vaughn等从草地夜蛾蛹的卵巢组织得到的。
培养液：TNM-FH培养液：照厂家的说明配好Grace's Antheraea 培养液，每升培养液加3.3g酵母粉和3.3g乳白蛋白水解物，用1M KOH调pH到6.2-6.4过滤除菌，4℃保存。完整培养液在使用前加入10%热灭活的胎牛血清。
传代：用吸液管吹洗细胞使其悬浮，或用手从侧面拍打细胞培养瓶(当用大细胞培养瓶时)重悬细胞。（当用来接种的细胞重悬前就有很多细胞漂浮，要吸掉漂浮细胞及旧培养液，加入新培养液重悬细胞。 按合适比例传代细胞到新培养器皿中。 （以1：5或更多为宜，每2-3天传代一次） 28℃培养（不用CO2培养箱）。
冻存：95%培养液+5%DMSO冻存于液氮。
BHK21细胞
来源：叙利亚仓鼠肾细胞 形态：纤维原细胞 生长特性：贴壁
注释：这个细胞来自于一只出生**的新生仓鼠，随后被改造成一个易于作表达的宿主细胞株。
培养液：MEM（ 含 2 mM L-谷氨酰胺 和 Earle's BSS，1.5 g/L NaHCO3, 0.1 mM 非必需氨基酸, 1.0 mM 丙酮酸钠）+ 10%胎牛血清
传代：吸去培养液。 用0.25%（w/v）Trypsin-0.03 mM EDTA洗一次，以去除血清（血清会抑制胰酶活性）。 加2-3毫升Trypein-EDTA，放37℃培养箱内约5分钟，直到细胞全部脱落。 加6-8毫升培养液，用移液器把细胞吹散。 加适量的细胞到新的培养器皿中。（以1：2到1：10为宜，每周传代1-2次）
冻存：95%培养液+5%DMSO冻存于液氮。
HepG2细胞
　　Hep G2细胞来源于一个15岁白人的肝癌组织。该细胞分泌多种血浆蛋白：清蛋白、α2-巨球蛋白、血纤维蛋白溶酶原、铁传递蛋白等。该细胞能大容量培养，乙肝表面抗原阴性，对G418有抗性，对人生长激素有刺激反应。
来源： 人肝癌细胞 形态：上皮细胞 生长特性：贴壁
注释：该细胞表达3-羟基-3-甲基戊二酸辅酶A还原酶和肝甘油三酸脂脂肪酶。该细胞在有百草枯(英文名：gramoxone)的环境下过氧化氢酶mRNA表达增加，ApoA-I mRNA 表达减少。
培养液：MEM（ 含 2 mM L-谷氨酰胺 和 Earle's BSS，1.5 g/L NaHCO3, 0.1 mM 非必需氨基酸, 1.0 mM 丙酮酸钠）+ 10%胎牛血清。
传代：吸去培养液。 用 0.25% (w/v) Trypsin- 0.53 mM EDTA洗一次，以去除血清（血清会抑制胰酶的活性）。 加2-3毫升Trypsin-EDTA，放在37℃培养箱内约5分钟，直到细胞全部脱落。 加6-8毫升培养液，用移液器把细胞吹散。 加适量的细胞到新的培养器皿中。（以1:4**1:6为宜，传代期间培养液每周更换2次）
冻存： 95%培养液+5%DMSO冻存于液氮。

DNA荧光染色法检测细胞培养中的支原体污染

原理：利用荧光染料（bisbenzimide,Hoechst33258）检测支原体污染。这种染料会结合到DNA的A-T福集区域，因为支原体的DNA中A-T含量高（55%-80%），所以可将其染色而检测。被支原体污染的细胞经染色后在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一的荧光小点，即为支原体的DNA，证明有支原体污染。
特点:简单、经济与灵敏，广泛使用，可作为例行的检测手段。可以检测不易培养的支原体，例如M.hyorhinis，比直接培养法快，约一周既可知道结果。
缺点：有时会有背景荧光，影响结果判断。
材料：
· Hank's balanced salt solution （不含NaHCO3 和酚红，HBSS，GibcoBRL 21250-014）、二苯并噻唑（bisbenzimide，Hoechst No.33258，Sigma B-2883）、thimerosol（Sigma T-5125）、0.1M柠檬酸、0.2M磷酸氢二钠、甘油、冰醋酸、甲醇、无菌水、chamber slide（Nunc 177380）或其替代物：35或60mm细胞培养皿内放无菌22x22mm盖玻片（浸于酒精中用前过火灭菌），染色后取出盖玻片细胞面朝下放玻片上观察。
· 指示细胞：Vero（ATCC CCL-81或CCRC60013）或3T6（ATCC CCL-96或CCRC60070），细胞须先测试无污染。MEM，10%FBS（Vero的培养液）。
试剂准备：
· 无菌HBSS：配置Hank's balanced salt solution，用0.22um无菌滤膜过滤除菌。
· Hoechst 33258 储存液（100x）：称取5.0mg二苯并噻唑和10.0毫克thimersol溶于100ml无菌HBSS，置于棕色瓶中，室温下以电磁搅拌器搅拌30分钟**完全溶解后，以1ml/支分装到1.5ml小离心管中，-20℃保存。
· Hoechst 33258 工作液：取1ml储存液加入100ml无菌HBSS中，室温下搅拌45分钟，置于棕色瓶中并以锡箔纸包裹，避广光保存于4℃。
· 封固溶液（mounting solution）：22.2ml0.2M 柠檬酸和27.8ml0.2M Na2HPO4加入50ml甘油中，用1N NaOH调pH**5.5（pH很重要），4℃保存。
· 固定液：冰醋酸：甲醇=1：3（v：v），用前配置。
步骤：
1. 培养Vero细胞：Vero细胞可作长期培养或制作多个冻存管，测试前解冻培养。测试前一周培养Vero细胞。
2. 在接种待测样品前一日，将Vero细胞以1-2x104细胞/ml培养于chamber slide中，每孔加入1ml细胞悬浮液，于37℃，5%CO2培养。隔日确定生长良好后即可接种待测样品细胞。
3. 接种待测样品：样品种类：1ml待测的培养基，1ml待测的细胞培养液（可刮下少许细胞）0.05-0.1ml 冷冻管的细胞悬浮液。
4. 将待测样品加入chamber slide内培养5天后，进行Hoechst 33258的荧光染色观察。
5. 以Acholeplasma laidlawii ATCC 23206感染Vero细胞作阳性对照，阴性对照用Vero细胞的新鲜培养基（MEM +10%FBS）。
DNA荧光染色检测：
1. 取出培养5天的Vero细胞，吸除培养液。每孔加2ml固定液，静置十分钟后吸除固定液，重复一次，风干10分钟。
2. 每孔加入1mlHoechst 33258 工作液，室温下静置30分钟。
3. 吸掉Hoeshst 33258染液后，用无菌水洗涤3次，风干后加入1滴封固溶液，并以盖玻片盖之。
4. 用100-400x荧光显微镜观察。打开汞灯10分钟后，用UV激发光（330-380nm）的滤光镜，观察细胞核外是否有兰色荧光小点或丝状点的荧光。
结果判断：如有支原体污染，在Vero细胞核外与细胞表面会出现兰色荧光小点或丝状点。其形状一致，与细胞残片染成的不规则点状物不同。其荧光可维持数周。（见上图）
怎样查到一个特定细胞株的相关知识和培养条件？
　　ATCC (American Type Culture Collection) 收集了jue大多数细胞的详细资料。打开ATCC网页的Cells and hybridomas链接，输入细胞名称就可以搜索ATCC的细胞数据库。
　　数据库中有每一种细胞的详细描述，包括细胞的来源，培养和冻存条件，以及相关文献等资料。
为什么大多数细胞培养需要用二氧化碳培养箱？
　　一般细胞培养液的pH在7.0-7.4之间。由于碳酸盐pH缓冲系统是一种生理pH缓冲系统（它是人体血液中**重要的pH缓冲系统），大多数培养液用它来保持稳定的pH。用粉末配制培养液时，常常需要加入一定量的碳酸氢钠。
　　对大多数以碳酸盐作为pH缓冲系统的培养液而言，以为了维持稳定的pH，培养箱中的二氧化碳需要维持在2-10%之间，以保持培养液中溶解的二氧化碳的浓度。同时细胞培养的器皿需要一定程度的透气，以便于气体的交换。
　　是不是采用其他pH缓冲系统就不需要二氧化碳培养箱了呢？人们发现由于空气中的二氧化碳浓度很低，如果细胞不在二氧化碳培养箱中培养，培养液中的HCO3-会被耗尽，这样会影响细胞的正常生长。所以大部分动物细胞的培养，还是需要二氧化碳培养箱。
　　细胞培养液中常附加其他的pH缓冲系统，比如HEPES缓冲系统，来增加pH缓冲能力。HEPES在pH7.2-7.4之间有很强的缓冲能力，当透气的培养器皿被拿到二氧化碳培养箱外面的时候，由于空气中二氧化碳浓度很低，培养液中碳酸盐缓冲系统就会失去效果，这时候HEPES缓冲系统就能继续保持pH的稳定。#p#分页标题#e##p#分页标题#e#

怎样化冻动物细胞？ 
　　化冻过程的原则是要让冻存的细胞快速融化。
　　如果细胞储存在液氮液面下，使用者**好准备好必要的防护器具（**少要戴上护目镜，**好戴上面罩和较厚的手套），防止进入冻存管的液氮骤然膨胀引起爆炸而造成伤害。从冰箱或液氮罐取出细胞后将冻存管放 37℃水浴轻轻晃动使之化冻完全，注意不要让水浸到盖子以防污染发生。
　　由于大多防冻剂与细胞长时间接触时对细胞有毒害，所以**好尽快除去细胞冻存时加入的防冻剂。#p#分页标题#e##p#分页标题#e#
　　防冻剂的去除方式和细胞的敏感性有关。有些细胞在某些防冻剂存在的条件下能很好的贴壁生长，可以直接将化冻的冻存细胞连同其冻存液加入预备好 15-20ml 培养液的细胞培养瓶或培养皿中，轻轻混匀后放入培养箱培养过夜后换培养液。
　　对于敏感细胞要加入 10ml 培养液中， 100xg 离心 5 分，去上清后加培养液轻轻重悬细胞，加入培养器皿后在培养箱培养，第二天更换培养液。