一、仪器、试剂
仪器：细胞培养瓶，移液枪，枪头盒（5ml、1ml、100μl、10μl），移液管（5ml、10ml），玻璃分装瓶（100ml、200ml、500ml），高压铝盒（离心管、冻存管），离心机（800转5min），倒置显微镜，细胞计数板，水浴箱（37℃）， CO
2培养箱（调整**37℃、5%CO
2）。
试剂：DMEM，Serum，Trypsin，P.S.，Puromycin，DMSO。
二、试剂配制
10ml Complete Media：DMEM 9ml；
Serum 1ml；
P.s. 100μl.
10ml Frozen Media：Complete Media 8ml；
Serum 1ml；
DMSO 1ml。
Puromycin(2μg/μl)：6μlPromycin/4ml CM
三、具体操作
1. 准备：取各种已消毒的培养用品（枪头盒、高压铝盒、分装瓶）置于净化台面，紫外线消毒30分钟，Media、Trypsin、Serum、P.S.、Puromycin从4℃冷藏拿出**室温待用（使用之前用75%酒精全面消毒）。开始工作前先洗手、戴上乳胶手套，用75%酒精喷拭手**肘部。
紫外灭菌时间到后，将灯和风机打开，开始工作。将Media、Trypsin、Serum、P.S.、Puromycin去除封口处密封条，用75%酒精喷拭全面消毒后拿进去待用（注意：使用之前，应充分摇匀）。合理摆放所需物品，尽量减少手部的大幅度摆动，点燃酒精灯，配置100ml Complete Media：用10ml移液管吸取DMEM 10ml*9次**分装瓶中，再吸取Serum 10ml**分装瓶中，再加入1ml P.S.用移液管吹打混匀后待用。
2. 辛 将待处理细胞取出后，倒掉原有的培养基；
安装5ml移液枪头后吸取PBS 5ml，每支细胞加入2.5ml，清洗细胞代谢物和培养瓶底部（清洗不干净会使胰酶消化变难），清洗过后倒掉PBS（垂直倾斜瓶各倒一次，一定要倒干净，防止残余PBS稀释Trypsin，影响酶解效果）。
然后，每支细胞加入0.5ml Trypsin，摇摆培养瓶使其充分覆盖瓶底，待每一支培养瓶都加入Trypsin摇匀后，再从**支开始，用力拍打培养瓶，左右摇摆使细胞都被消化下来，不在贴壁，依次拍打各支细胞，观察，使其全部都消化完全（注意：控制消化时间不要太久，把握不好就要再显微镜下观察）。然后再加入3倍体积的Media 1.5ml于培养瓶中，终止其消化。再确保枪头无污染的前提下，同一种细胞可以用同一个枪头来吹打细胞（仔细吹打培养瓶，尤其是边边角角），使其成为单细胞悬液。
3. 提前用镊子准备出4ml离心管，对应每一支细胞，
做好标记。再细胞吹打完全后，用移液枪将细胞悬液转移**离心管中，用密封条封好口。待所有细胞都转移**离心管后，①将待冻存的细胞放置于准备好的碎冰中保存待用（合理放置防止染菌）；②将用于分瓶传代的细胞先800转离心5min（离心过程中，每一支培养瓶中加入3.5ml Media）后取出，去除封口膜，用酒精喷拭后（确保密封），
打开瓶盖后烧瓶口灭菌，小心倒掉上清后烧瓶口灭菌，然后加入1ml或1.5ml Media吹打均匀（注意：不要产生大量气泡）后，对应各自的培养瓶，均匀的进行一分二或一分三传代，摇晃均匀，观察后，放入CO
2培养箱中继续培养。
4. 将①等待冻存的细胞悬液，进行800转离心5min。在此期间，配制冻存液ep:10ml，可在用完的serum15ml离心管中，加入8ml Media，1ml serum，1ml DMSO，吹打混匀后待用；然后用镊子取出对应的n支冻存管，做好标记（名称、日期、作者姓名shou字母缩写）。
离心结束后，取出离心管，去除封口膜，用酒精喷拭后（确保密封），
打开瓶盖后烧瓶口灭菌，小心倒掉上清后，烧瓶口灭菌，然后加入2ml配好的冻存液，吹打均匀后，进行1分2的冻存，待所有细胞处理完全后，先**于-20℃中等待，然后转移**-80℃冰箱中保存，并做好冻存记录。
注意事项:
1、
严格无菌操作，打开/拧上瓶盖时一定要烧瓶口灭菌。
2.凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面，并靠近酒精灯火焰操作。
3.器皿使用前必须过火灭菌。
4.继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。
5.各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸。
6.吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。
四、细胞的冻存（补充）
1.先将冻存管放入4℃冰箱，约40min。
2.接着置于-20℃冰箱，约30-60min。
3.置于-80超低温冰箱（可保存半年）中放置过夜。
4.置于液氮罐中长期保存。
5同时做好冻存记录，在自己的笔记本和冻存记录本上均要记录。
6.不宜将冻存细胞放置在0℃～-60℃这一温度范围内过久，低温损伤主要发生在这一温度区内，是“危险温区”。
补充1： 细胞复苏的原则
快速融化：必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化**37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。#p#分页标题#e##p#分页标题#e#
具体操作
一. 实验前准备：
1.将
水浴锅预热**37℃。
2.大 紫外线照射30min的超净工作台台面。
3.在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、枪头盒、培养瓶等。
二．取出冻存管：
1.根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。
2.从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。
三．迅速解冻：
1.迅速将冻存管投入到（注意：管口在液面以上避免染菌）已经预热的
水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。
2.彪 约1-2min后冻存管内液体完全溶解，再配平放入离心机中800r/min 离心5min后，取出后去除封口膜并用酒精喷拭冻存管的外壁和管口，用酒精灯烧瓶口后，小心吸弃冻存液，加入1ml Media，吹打制成细胞悬液，将细胞悬液分装入培养瓶内，加Media**4ml后，将培养瓶放入37℃和5%CO2的
培养箱内培养，换液的时间由细胞情况而定。
补充2： 细胞计数
实验原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。
具体操作：
一.准备工作：
取一瓶传代的细胞，按照《传代细胞培养（消化法）》中的传代方法繁殖细胞，待长成单层后以被使用。
二.细胞悬液制备：
细胞悬液的制备方法是用PBS液洗涤、0.25％的胰蛋白酶液消化后，加入培养液，吹打制成待测细胞悬液。
三.细胞计数：
1.盖好盖玻片：取一套血球计数板，将特制的盖玻片盖在血球计数槽上。
2.cc 制备计数用的细胞悬液：用吸管吸5滴细胞悬液到一离心管中，加入5滴台盼蓝染液（0.4％）或苯胺黑，活细胞不会被染色，加入染液后就可以在显微镜下区别活细胞和死细胞。
3.将细胞悬液滴入计数板：将待测细胞悬液吹均匀，然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入，要保证盖片下充满悬液，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。
4.统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，当看到镜中出现计数方格后，数出四角的四个大格（每个大格含有16个中铬）中没有被染液染上色的细胞数目。
5.计算原细胞悬液的细胞数:按照下面公式计算细胞密度：
（细胞悬液的细胞数）/ml＝（ 四个大格子细胞数/4) ×2×10
4
说明：公式中除以4因为计数了4个大格的细胞数。
公式中乘以2因为细胞悬液于染液是1：1稀释。
公式中乘以10
4因为计数板中每一个大格的体积为：
1.0mm（长）×1.0mm（宽）×0.1mm（高）＝0.1mm3 而 1ml＝1000mm3
四.细胞计数要点：
1.进行细胞计数时，要求悬液中细胞数目不低于104个/ml，如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中；
2.要求细胞悬液中的细胞分散良好，否则影响计数准确性。
3.取样计数前，应充分混匀细胞悬液，尤其时多次取样计数时更要注意每次取样都要混匀，以求计数准确；
4. 数细胞的原则是只数完整的细胞，若细胞聚集成团时，只按照一个细胞计算。如果细胞压在格线上时，则只计上线，不计下线，只计右线，不计左线。
5. 操作时，注意盖片下不能有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中，否则要重新计数。
五.初学者易犯的错误：
1. 计数前未将待测悬液吹打均匀。
2. 滴入细胞悬液时盖玻片下出现气泡。
3. 滴入悬液时的量太多，**使细胞悬液流入旁边的槽中。
