人的外周血淋巴细胞培养

摘  要 淋巴细胞是免疫系统中**重要的细胞，在免疫中起关键作用，维持内环境的稳定。对人的外周血淋巴细胞进行染色体核型分析对人类遗传研究及临床应用有重大意义。每一物种都有一定数目及一定形态结构的染色体，可在显微镜下观察到。本次实验的目的就是掌握人体微量血液体外培养制备染色体标本的方法并学习对人的外周血淋巴细胞进行核型分析。
每1ml 外周血中一般含有约1～3×10⁶个小淋巴细胞， 几乎都处于G1期或G0期的非增殖状态 ，一般情况下是不再分裂的。但当在培养液中加入植物凝血素（PHA）后，淋巴细胞受刺激便转化为淋巴母细胞，重新进入增殖周期，进行有丝分裂。经过66～72小时(三个周期)的短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂相细胞，从而进行染色体标本制备和核型分析。这种微量全血培养技术已在临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面得到了广泛应用。
本实验采取了人类的外周血进行实验，经各种技术处理后**后得到较为清晰的人体染色体照片。 通过实验发现：人类每个体细胞有46条染色体，22对常染色体和一对性染色体，男性是46，XY；女性是46，XX。 根据染色体的形态、大小、及着丝粒的位置，将人的外周淋巴细胞的46条染色体分为A、B、C、D、E、F、G7组共23种类型。
 
关键词  人的外周血淋巴细胞  染色体  低渗溶液    核型分析  秋水仙素  动物细胞体外培养
  
Human Peripheral Blood Lymphocyte Culture
 
 
Abstract: Lymphocytes are among the most important immune system cells in the immune plays a key role in together, in order to maintain a stable environment. To analyze chromosome of lymphocytes is very important. Various biological chromosome number and shape are constant,can be seen under a microscope. The purpose of this experiment is human body trace blood samples were cultured in vitro chromosome preparation methods and studying on the peripheral blood lymphocyte karyotype analysis on.
In human body's 1ml circumference blood includes approximately 1~3×106 the small lymphocyte generally, usually they are between time G0 and the G1 time, generally is not divided. But when adding plant in medium coagulopathy (PHA), lymphocyte transformation and stimulated for lymphatic mother cell proliferation capacity, make its recovery, then entering mitosis. After 66~72 hours(three cycles) short-term training, autumn grain processing, daffodil, low permeability and fixed can be gained lots of mitotic cells, for makes the chromosome specimen preparation and analysis. This kind of micro whole blood culture technique in aspects and so on clinical medicine, virology, Pharmacology, heredity toxicology obtained widespread application.
The experimental taken to conduct experiments on human peripheral blood, the various technical ultimately be treated more clear picture of human chromosomes. Through the experiments have found that each human somatic chromosome, 22 to 46 euchromosome sex chromosomes, and a pair of 46 XY; male is, Women are 46, XX. This method has been clinical medicine and virology, pharmacology, genetic toxicology etc widely. According to the chromosomes of the shape, size, and the centromere position, the peripheral lymphocytes 46 chromosomes into A, B, C, D, E, F, the G7 group of 23 types.
 
Key words: Human blood lymphocytes   Chromosome   Low permeability solution   
Karyotype analysis   Autumn daffodils element  zooblast in vitro raise offcenter
 
前  言 
细胞培养技术是目前生命科学研究*域的一项常用而重要的技术，它涉及的技术有：无菌操作技术、细胞分离技术、细胞培养技术、显微摄影技术、图像分析技术等。
Moorhead和Levan等(1960)建立的人体外周血淋巴细胞培养技术，以及Rothrels等(1958)建立的气干法制片技术，成了研究人与哺乳类染色体的**主要技术。这种取材简易、用血量少的培养方法已被临床医学、病毒学、药理学，遗传毒理学等方面广泛采用。细胞培养是一种程序复杂而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞在体外长期生存，必须模拟体内环境，共给细胞存活所必需的条件。如供给适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖以及有关的生长因子；氧气及适宜的温度；注意调节其外环境的酸碱度（pH）与渗透压；以及为排除细胞代谢产物的危害，保持良好适宜的外环境而进行必需的传代等等。所有这一切条件与操作都要保持在无菌条件下进行。
人们对许多动植物的染色体进行广泛研究^【1】，并取得了可喜成果，可对哺乳动物及人类染色体研究进展不大。其原因在于：1） 不易获得分裂过程中的细胞；2）过去的传统方法多为切片、压片，对描述染色体结构不准确，技术不高；3）人类染色体数目多，大小不同，彼此重叠。
1912年，Warfter **先研究人类染色体。
1923年，报道人类染色体的二倍体为48条。
1956年，J.H.Tjio A.Levan 培养人胚组织细胞，计数人体细胞染色体数为46条。
1960年，Moorhead建立人体外周血培养技术，使染色体的研究跃进一步。
1968年，T.U. Casperssan提出染色体显带技术。
自1956年Tjio（庄有兴）和Levan确定人类染色体数目为46个后，在1960年的Denver会议和1963年的London会议制定了统一的人类染色体命名体制：按照染色体的相对长度、臂比和着丝粒指数，将常染色体（22对）按大小用阿拉伯数字标记，顺次排列为1～22号，性染色体用X和Y标记；并按染色体大小和着丝粒位置，把人类染色体分为七个组，用大写字母A～G表示，把人的46个染色体分为7个群#p#分页标题#e##p#分页标题#e#^【2】。但对识别每一个染色体仍有很大困难，尤以C组更难区别。1970年，发现染色体分化染色，并于1971年召开了G际性巴黎会议，为G、Q、C和R带四种分带技术建立了命名法。以后又逐步建立了Giemsa11分化染色法及染色体脆性位点显示法。为染色体遗传病诊断、杂种细胞检定、特殊细胞株标记、染色体的识别等开创了一系列检测方法，大大加速了染色体研究的进展。
细胞遗传学组织培养技术为人类染色体的研究提供了条件。技术突破主要在于^【3】[4]：
1）人体外周血淋巴细胞培养和PHA的应用。PHA 是从菜豆种子中提取出来的，大量的PHA具有凝血作用。如果适合，可刺激细胞转为母细胞，从而进行有丝分裂。
2）秋水仙素的应用。秋水仙素可阻断纺缍体截止于中期，使染色体个体大，结构清晰，缩短适度，细胞质粘度降低。
3）低渗处理（水或0.075mlKCl）使红细胞胀破，白细胞胀大，染色体空间变大，易伸展,便于观察。
通过本实验掌握人体外周血离体培养制备染色体标本的方法。人体外周血的形成包括红细胞、白细胞、血小板，其中红细胞和血小板不能离体培养，白细胞中含有小淋巴细胞。 所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。外周血淋巴细胞是不能增殖的分化细胞群，在体外无菌培养条件下，若于培养基中植物凝集素(PHA)则可刺激处于G1期或G0期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，重新有丝分裂的能力，经一段时间的培养，秋水仙素的处理 ，低渗和固定， 即可获得大量分裂期细胞以供染色体分析。秋水仙素可通过干扰微管组装而抑制纺锤丝形成，使细胞分裂顺利进入后期而停滞于中期，从而可在短期内积累大量**适于进行染色体分中期分裂相^【5】。此外，秋水仙素还能使染色单体缩短、分开，使染色体呈现明显形而利于辨认。
本实验中采用体外培养和低渗技术。体外培养的原理是将离体的细胞放入培养基中进行生长繁殖，保持细胞的生命活力，便以对细胞进行各方面的研究。通过许多学者的改进和革新，培养基由天然的动物血浆改为合成培养基，促进细胞生长的物质从胎汁改为动物血清，本实验中用的小牛血清。体外培养技术已经广泛应用在杂交瘤技术制备单克隆抗体，动物细胞的大规模培养，微生物制药技术，基因转染与细胞融合以及细胞转化工程技术等方面。低渗处理的目的是使水分通过细胞膜向细胞内渗入，导致转化的淋巴细胞，染色体进一步分散而利于分析。同时，低渗处理还可使红细胞质膜破裂，经后血影浮于上清中被去除，后续的固定过程主要针对淋巴细胞，改善了淋巴细胞的固定质量及标本质量。
1．材料
1.1  材料   人的外周血淋巴细胞
1.2  药品             
1.2.1  RPMI1640培养基^[6]，含有20种氨基酸，维生素，生物素，碳水化合物，无机物。
1.2.2  肝素，作为抗凝剂使用，主要起抗凝血作用。
1.2.3  秋水仙素，作为有丝分裂的阻止剂，它能改变细胞质的粘度，抑制细胞分裂时纺锤体形成，使细胞分裂停留在中期。 
1.2.4  植物凝血素（PHA），是淋巴细胞有丝分裂刺激剂，激活细胞分裂 。
1.2.5  双抗：青霉素、链霉素为广谱抗生素，杀菌。
1.2.6  0.9%生理盐水，维持人的外周血淋巴细胞内环境稳态。
1.2.7  固定液，甲醇：冰醋酸=3：1使血清蛋白、核蛋白凝固。
1.2.8  姬姆萨染液，Giemsa染色液使染色体染色。
1.2.9  0.1mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4～7.6)，维持细胞内环境稳态。
1.2.10 低渗液：0.075mol/L KCl或蒸馏水。使细胞胀大，染色体铺展，轮廓清晰，染色增强。
1.2.11 3.5％NaHCO3溶液，调节pH值。
1.2.12 小牛血清，促进细胞繁殖和维持pH值。
1.3 药品的配制
RPMI“1640”培养基：称取“1640”粉末1.05克，用100ml的蒸馏水溶解，加入NaHCO₃ 0.11克，吹CO₂气体校正pH**7.2。
肝素：称取肝素钠8毫克，用2ml的生理盐水溶解，此溶液的浓度为500单位／ml。
秋水仙素：称取秋水仙素1毫克，用25ml生理盐水溶解，此溶液的浓度为40微克/毫升。取0.1mL的该溶液加入5毫升的培养物中，其**终浓度为0.8微克/毫升。
植物凝血素(PHA)：取3支加6ml蒸馏水溶解。
青霉素（每瓶80万单位）：以8ml生理盐水稀释，得10万单位/ml；以160ml生理盐水稀释，则得5000单位/ml。取0.1ml加入5ml培养基中，则**终浓度为100单位／ml。
链霉素（每瓶100万单位）：以1ml生理盐水稀释，得100万单位/ml；以200ml生理盐水稀释，则得5000单位/ml。取0.1ml加入5ml培养基中，则**终浓度为100单位／ml。
0.9%生理盐水：称取氯化钠2.7克，溶解于300ml的蒸馏水中。
固定液：甲醇:冰醋=3:1配制。
姬姆萨染液：0.5克姬姆萨粉末，加33ml纯甘油，在研钵中研细，放在56℃水浴锅中保温90分钟，再加入33ml甲醇，充分搅拌，用滤纸过滤，收集在棕色细口瓶中中保存，作为原液。用时以磷酸缓冲液1∶10稀释。
0.1mol／L磷酸缓冲液： pH 7.4~7.6
Na₂HPO₄ •12H#p#分页标题#e#_{2#p#分页标题#e#}O    28.8克
KH₂PO₄（无水）       2.67克  
溶解于1000ml双蒸馏水中。                                         
低渗液：0.075mol/LKCl或蒸馏水。
3.5％NaHCO3溶液：称取NaHCO₃3.5克，溶解于100ml的蒸馏水中。
1.4 器具   电子天平  移液管  2mL灭菌注射器  试管架  量筒  烧杯  试剂瓶  培养瓶
毛细吸管 采血针 恒温培养箱（37℃） 离心机  离心管  酒精灯  显微镜  载玻片
     
2.方法
2.1 培养液的分装：超净工作台中，用移液管将下列溶液按要求装入培养瓶内：
       培养液（ RPMI-1640 ）        4mL
小牛血清                     1mL
PHA                         0.2mL
肝素                        0.05mL
双抗                  浓度为100单位/mL
用3.5％NaHCO₃（无菌）调pH**7.2。拧紧盖子，置于0℃条件下保藏。 用前从冰箱中取出放在37℃恒温锅中温育10min。
2.2  采血：用2mL灭菌注射器吸取肝素0.05mL湿润管壁管壁，用酒精棉在一手指尖消毒，待酒精挥发后用消过毒的采血针取适量血，用毛细血管吸取并将血吹培养瓶中，充分摇匀后置37℃±0.5℃恒温箱内培养。
2.3  培养：置37℃恒温箱内培养69h。用蒸馏水
2.4  秋水仙素处理：终止培养前2.5h，在培养液中加入秋水仙素0.1mL，**终浓度为0.8 μg/mL。 
2.5  收集细胞：将培养物转入洁净离心管中。
 
2.6  载玻片的冰浴处理：于烧杯中用蒸馏水浸泡载玻片，放到冰箱中备用。
 
2.7  低渗处理: 加入预温37℃的5mL 蒸馏水, 用吸管轻轻吹打成细胞悬液, 37℃恒温箱内处理
              20min，使红细胞破碎，白细胞膨胀。
 
2.8  离心：1000r/min ，离心5min, 弃去上清液，收集白细胞。
 
2.9  固定：固定液为甲醇:醋酸=3:1。每只离心管中加入固定液2mL,片刻后用滴管轻轻冲打成细胞悬液，在室温中固定15min后,离心，吸弃上清液,留下白细胞。
 
2.10  再固定: 加入固定液2 mL，用吸管轻轻打散，室温中继续固定15min。
 
2.11 再离心：1000r/min离心5min, 弃去上清液，留下白细胞制片。
 
2.12 制悬液：弃上清液后，视细胞数量多少加入适量固定液制成细胞悬液。向离心管中加入固定液0.5mL,用滴管轻轻冲打成细胞悬液。
 
2.13 滴片：用吸管吸取细胞悬液自1m高滴在从冰箱中取出的一张干燥洁净的载玻片上，轻轻吹散，在酒精灯上微微烤干。
 
2.14 染色：用磷酸缓冲液（pH 7.4）稀释过的姬姆萨染液(1：10）染色20min，倒去染液，用蒸
   馏水轻轻冲洗。
 
2.15 镜检：待稍干后，显微镜观察。低倍镜下寻找分散良好、染色适中的分裂相，再在油镜下观
         察，选择染色体清晰，分散度好的细胞进行核型分析。
      
3.实验结果
3.1结果：人体外周血淋巴细胞染色体（46,XY）示意图 
 
理论上应该观察到的染色体图:
 
 
                           人体外周血淋巴细胞染色体图（４６，XY）
实验所得染色体图:
           
人体外周血淋巴细胞染色体图（４６，XY）
3.2核型分析
 
3.2.1计算：
三个参数：
        单个染色体长度×1000
染色体的相对长度＝ —————————————————————
                           22条常染色体长度+1条X染色体长度
 
短臂长度
着丝粒指数 ＝ ————————×100
                     染色体全长#p#分页标题#e##p#分页标题#e#
 
 
长臂长度（q）
臂比率 ＝ ————————
                 短臂长度（p）
 
3.3.2常规染色体核型分析 
(1)染色体是遗传物质的载体，存在于分裂间期细胞的细胞核内。每一个体细胞含有两组染色体组，一组来自父方，一组来自母方，用2n表示。其中与性别直接有关的染色体，即性染色体，可以不成对。人类每个体细胞有46条染色体，22对常染色体和一对性染色体，男子是46，XY；女子是46，XX。 
(2)染色体在复制以后，纵向并列的两个染色体，往往通过着丝粒连在一起。着丝粒在染色体的位置是固定的。由于着丝粒位置的不同，可以把染色体分成相等或不等的两臂，造成中间着丝粒，亚中间着丝粒，亚端部着丝粒和端部着丝粒等形态不同的染色体。此外，有的染色体还含有随体和次级缢痕。所有这些染色体的特异性构成一个物种的染色体组型。染色体的核型反映了细胞中染色体数量和结构的特征。根据染色体的形态、大小、及着丝粒的位置，将人的外周血淋巴细胞的46条染色体分为A、B、C、D、E、F、G 7组共23种类型。每组染色统体形态大小不同，X染色体归入C组，Y染色体归入G组。^［7］本实验的人外周血淋巴细胞采于他人（男性）。根据各组染色体的特征予以分组：
A组：（N01～03）是**大的一组染色体，它们的着丝粒在中部或几乎在中部；
B组：（N04～05）为两对大的亚中着丝粒染色体，它们有明显的长臂和短臂；
C组：（N06～12+X）为中等大小的亚中着丝粒染色体，它们大小相差不多，X染色体大小介于期间，一般难以区分；
D组：（N013～15）为中等大小的端着丝粒染色体，它们的一个重要形态特征是随体，随体是一对着色很深的小球，处于短臂的末断，随体与短臂之间的区域很少着色；
E组：（N016～18）为一对中着丝粒染色体、亚中着丝粒染色体和一对近端着丝粒染色体；
F组：（N019～20） 为两对小的中着丝粒；
G组：（N021～22+Y）为**小的一组端着丝粒染色体，在N021～22的短臂上可见随体，Y常呈现异固缩状态，着色更深，可以识别。
（3）下图为人的外周血淋巴细胞染色体组型分析图 ：男（46，XY）
       
                       人类的染色体组型分析图   男（46，XY）
   4.分析与讨论
 
4.1培养条件对实验结果的影响： 培养液   培养时间   PHA  pH
  培养液： ①一定范围内培养价值愈高，转化率相对也较高；
②过酸或过碱都会影响细胞生长，**适pH为7.2-7.4 。
     培养时间: 在一定限度内，培养时间越长，转化率越高。但如果用PHA激发，培养超过4-5天，转化率反而降低，故通用时间为72小时。
      PHA：   G内所用PHA一般为粗制品（英文缩写为PHA—M，含多糖的蛋白质成分；精制品PHA—P，纯蛋白质成分）。在正式实验前，必须测定所选用产品的**适浓度，即将PHA稀释成不同浓度，按正式实验方法检测同一样本。PHA浓度太高时细胞有毒性，太低不足以刺激T细胞转化，一般**适浓度为50-200μg/ml。PHA添加很重要，如保存不善，效价低或数量不足，则作用差，但浓度过大，红细胞凝块，这些都会影响细胞生长。
pH:  不适于细胞生长的环境
 
4.2染色体标本制备过程中有两个重要环节，其原理是：
(1)低渗处理：目的是使水分通过细胞膜向细胞内渗入，导致转化的淋巴细胞，染色体进一步分散而利于分析。同时，低渗处理还可使红细胞质膜破裂，经后血影浮于上清中被去除，后续的固定过程主要针对淋巴细胞，改善了淋巴细胞的固定质量及标本质量。
(2)固定：目的在于尽快使细胞的结构固定于接近存活的状态，以便作进一步处理，若不固定则可因细胞内蛋白质分解而导致结构变化。染色体研究中常用固定液为甲醇一冰醋酸(3：1)固定液。冰醋酸渗透力强，固定迅速，但易使组织膨胀而甲醇则可使组织收缩，两者混合使用能抵消各自的缺点，得到较好的固定效果。固定液纯度要高，临用时新鲜配制，应沿管壁慢慢加入后打匀，如果固定液加入太快，会使固定作用过强，染色体扭转；固定液作用不足，染色体出现毛刷状。
 
4.3染色体标本质量不佳的原因。如果淋巴细胞转化试验表明培养物生长发育良好，但制成的标本质量不佳时，其原因可能为：
（1）秋水仙素处理不当：一般秋水仙素溶液的浓度与处理时间有一定的关系，如果处理时间太短，则标本中的分裂细胞就少，相反，如果处理时间太长，则标本中的分裂细胞虽多，但其染色体缩得太短，以致形态特征模糊，不容易观察。
（2）低渗处理不当：低渗处理细胞时间过长，细胞膜往往过早破裂，以致分裂细胞或染色体丢失；如果处理时间不足时，细胞膨胀不够，则染色体分散不佳，难以进行染色体计数分析。#p#分页标题#e##p#分页标题#e#
（3）离心速度不合适：如果从培养瓶收集细胞后进行离心时的速度太低，细胞可能被丢失；如果细 胞被低渗后离心速度过高，往往使分裂细胞过早破裂，分散良好的分裂相丢失，以致制出的标本分裂相较少或大部分为剩余的分散不好的分裂相。
（4）标本固定不充分：如固定液不新鲜，甲醇、冰醋酸的质量不佳，此时染色体形态模糊、不分散，其周围有细胞浆的蓝色背景。
（5）载玻片清洗不彻底：玻片有油迹，致使滴在载玻片上的细胞悬液不能均匀分散，且细胞随液体流动而丢失。
（6）载玻片冷冻不够：合适的冰湿玻片，从冰水中拿出时，其表面有一层霜雪。如冷冻不够则无此现象，此时细胞难以贴附在载玻片上。
（7） 血样不同实验效果有异，据观察采血后三周，染色体效果**佳。可能是血样的差异以及观察时间影响实验结果。
（8） PHA添加很重要，如保存不善，效价低或数量不足，则作用差，但浓度过大，红细胞凝块，这些都会影响细胞生长。
（9） 在培养中成败的关键，除了**为重要的PHA的效价外，培养的温度和培养液的酸碱度也十分重要。人的外周血淋巴细胞培养**适温度为37±0.5℃。培养液的**适pH7.2—7.4。
（10）培养过程中，如发现血样凝集，可将培养瓶轻轻振荡，使凝块散开，继续放回37℃恒温箱内培养。
（11）制片过程中，如发现细胞膨胀得不大，细胞膜没有破裂，染色体聚集一团伸展不开，可将固定时间延长数小时或过夜。
（12）无菌操作是培养成败的关键，采血时要注意无菌操作，试剂配置要进行无菌过滤，所用培养器械要进行灭菌处理。
（13）细胞太多或太少亦能影响分裂相的多少，及标本质量。
 
4.4核型图中染色体有的变粗，而有的很细小。造成这种结果的原因可能是秋水仙素处理不彻底，一部分染色体加倍，而一部分没有。
 
5. 实验注意事项
 
（1）载玻片一定要洁净，否则染色体分散不好。
（2）人的外周血淋巴细胞培养的**适温度是36.5℃～37.5℃，培养液的**适pH是7.2～7.4。
（3）培养过程中如发现血样凝集，可将培养瓶轻轻振荡，使凝块散开，继续在37℃恒温箱内培养。 
（4）制片过程中，如发现细胞膨胀的不大，细胞膜没有破裂。染色体没有凝集在一团伸展不开，可将固定时间延长数小时或过夜。同时正确的掌握制片技术。^［8］
（5）秋水仙素的处理，低渗和固定，可获得大量的有丝分裂细胞。
（6）低渗处理极为重要，低渗使红细胞膜破裂，淋巴细胞膨胀，低渗处理浓度及时间要适当。低渗后混匀细胞一定要轻，否则引起膜破裂、染色体散失。低渗不够，则染色体聚在一起，分散不好。太过，则造成细胞破碎，染色体丢失。^［9］ 
（7）离心速度太高，细胞团块不易打散，速度太低，则会丢失细胞。
（8）机械打散细胞团时，用力要适度，若用力过猛，细胞易破碎，染色体不完整。
（9）秋水仙素处理时间过长，分裂细胞多，染色体短小；反之，则少而细长。都不宜观察形态及计数。故秋水仙素的浓度及时间要准确掌握。^［10］
（10）培养液及培养试剂应放在固定的位置，为避免光照试剂不能放在玻璃门的冰箱中，试剂周围不能放同位素。培养液从冰箱中取出后应在室温中放置一段时间后再进行实验，以避免过冷的温度对细胞的影响。
（11）接种的血样越新鲜越好，**好是在采血后24h内进行培养，如果不能立刻培养，应置于4℃存放，避免保存时间过久，否则会影响细胞的活力。
 
6. 实验不足及改正
    整个实验周期长，操作繁琐，多环节，易受不确定因素干扰。使得实验过程中仍存在一些问题， 
例如：由于未经显带且有破碎，试验结果不是很明显，并不能从图得到非常正确的结论。具体操作中应严格按照注意事项要求进行。