细胞培养方法

2007-10-03 | 软琼脂集落形成率实验(软琼脂克隆) 

将1.2％低熔点琼脂糖与2×细胞培养基以1:1 的体积比混合制备0.6％的底层琼脂，6 孔板中每个孔1.4ml 温室凝固，取对数期细胞，胰酶消化后吹散成单个细胞悬液，计数，并调细胞浓度为10000 个/ml，将0.6％低熔点琼脂糖与2×细胞培养基以1:1 的体积比混合，制备0.3％的上层琼脂，每孔加1ml 上层琼脂和100ul 单细胞悬液（约1000cell/well)，混匀，室温凝固。置于37℃，5％CO2 的细胞培养箱中培养2－3 周，计数含50 个细胞以上得克隆，计算细胞集落形成率，SpotII 采集图像。
2007-10-03 | MTT检测细胞增殖及见解 

细胞以每孔3000个接种**96孔板，分成不同组，每组3孔，利用含有10％ 胎牛血清的DMEM培养液培养24 h之后，向培养液中加入一定工作浓度的药物（单体或混合物），继续培养24 h或48h。培养结束，直接向每孔加入5mg/ml的MTT 10μl，孵育2－4小时（应常在显微镜下观察）。去除培养液，每孔加入DMSO 100μl，充分振荡3分钟，立即在酶标仪上测定490nm的吸光度值。
由于这种方法基于琥珀酸脱氢酶的活性，因而加入MTT之后应该在显微镜下观察，药物是否可以改变细胞琥珀酸脱氢酶的活性。若是改变则不可以使用此种方法。
另有根据细胞ATP含量测定细胞增殖的方法，但是都要考虑药物对细胞ATP是否有影响。
所以测定细胞增殖，**简单，**原始，**麻烦的方法，进行细胞计数我们感觉还是**好的方法。
细胞培养方法
哺乳动物细胞培养规则：
1，  严格按照细胞培养室规则进行哺乳动物细胞，由于细胞为整合生物中心共用，使用紧张，在使用时尽可能提高速度，保证操作规范。
2，  使用细胞间之后，主动将安全柜台面和桌面等清理整齐干净。
3，  在自己培养细胞出现污染之时，及时通报同一培养箱培养细胞者，并将培养相关细胞的培养液/PBS/胰酶等全部清出细胞培养室，以减轻对细胞培养的影响。
4，  实验所用细胞培养原则要求：A，细胞复苏之后两代开始使用；B，保证细胞每次传代前密度不超过90%；C，细胞使用**多12代（约2个月）。
5，  **好每天观察细胞生长状态，若有异常及时处理。
6，  具体参照www.atcc.org中细胞培养要求。
 
细胞传代方法
1，  将长**80-90%细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。
2，  加入0.5—1ml 0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。
3，  瓶口用瓶盖盖好，放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞逐渐趋于圆   形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入适当体积的培养液终止消化。观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1—3分钟。根据不同细胞而异。
4，  用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，尽可能的避免气泡产生，分到另外两到三瓶中，置37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。
5，  细胞培养液参照www.atcc.org，一般含有10%胎牛或小牛血清。
96/24孔板传代：
1，  前同于普通细胞传代方法。
2，  细胞吹打均匀后，对细胞进行计数，根据需要调**适当浓度。例如：每孔传代10000个细胞，可以将细胞调**浓度十万，之后利用排枪，吸取100ul，**96孔板中。
3，  24孔板，采用1ml移液器进行传代。
 
细胞冻存方法
 
1，  预先配制冻存液：含90%FBS，10%DMSO的冻存液，DMSO液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞；
2，  取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液（1×10⁶ ～ 5 ×10⁶细胞/ml)；
3，  加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称/冷冻日期/操作者。
4，  放于程序降温盒，之后在-80℃冰箱过夜。
5，  将程序降温盒中细胞放于液氮保存。
6，  要保证冻存细胞数量。
 
细胞复苏方法
1，  从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～38 ℃水浴中，不断摇动使其融化（1分钟左右）；
2，  尽快用培养液稀释**原体积的10倍以上；
3，  低速离心10分钟，1000转；
4，  去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。
5，  尽快对复苏细胞进行换液。
6，  扩大培养后，再冻存**少复苏数量的细胞，以保证细胞库的完整。
 
细胞计数
1、将血球计数板及盖片用双蒸水擦试干净，并将盖片盖在计数板上。
2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。
3、静置3分钟。
4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：细胞数/ml＝4大格细胞总数/4×10000
 
实验前准备下列物品：双蒸水 瓶子（500ml、250ml），离心管，tip头，Eppendorf管，滤纸，餐巾纸，微量加样器20-50µl。  具体实验步骤如下：#p#分页标题#e##p#分页标题#e#
细胞总蛋白的提取
 利用RIPA细胞裂解液，提取经处理细胞的总蛋白，根据RIPA试剂盒提取步骤如下：
1，收集细胞，加入300µlRIPA和3µlPMSF（不可以预先加入PMSF），利用枪头吹打，放置于冰上30min
2，将样品于4℃、30min、20000g离心
3，小心将上清液转移到新的离心管中，分装成每管25µl，于－70℃保存
4，两份5µl的细胞裂解液，稀释10倍之后，利用BCA法测定蛋白质浓度。
利用BCA－100蛋白质定量测定试剂盒（购自上海申能博采生物科技有限公司）测定蛋白质浓度，步骤如下
 
1，SolutionA and SolutionB混合液（根据需要确定混和量，A：B＝50：1）
A，绘制标准曲线和加样，如下表3－4：

	1	4	5	7
BSA（μl）	0	1.25	2.5	5
A＋B（μl）	100	98.75	97.5	95
OD570	0.005	0.063	0.123	0.243
OD570	0.003	0.067	0.128	0.245
OD570	0.006	0.065	0.120	0.248
OD570（平均值）	0.0046	0.065	0.1233	0.245
浓度（μg/ml）	0	100	250	500

 
B, 将上述加好的样品放于酶标板
C，将酶标板放于37℃摇床放置30min
D，取出酶标板，利用酶标仪测定其OD570
E，绘制标准曲线，如图：3－1
E，根据标准曲线测定样品的浓度。
F，稀释之后样品浓度测定值如下表3－5：

NaF浓度	0	4mM	6mM	8mM
样品量（μl）	5	5	5	5
A＋B（μl）	95	95	95	95
OD570	0.095	0.090	0.099	0.080
OD570	0.090	0.086	0.096	0.086
OD570	0.098	0.089	0.098	0.085
OD570（平均值）	0.094	0.088	0.098	0.084
浓度（μg/ml）	179.7	167.0	188.2	158.6

 
配制SDS－PAGE胶
将垂直电泳用玻璃，先用自来水冲洗多次，之后利用蒸馏水冲洗干净，放置于烘箱中烤干，将玻璃放置在制胶架上，根据上述PAGE胶的配置方法配制分离胶，之后将配制胶灌于两个玻璃之间**距梳齿0.5cm或距玻板1.5cm处标记(胶会收缩)。 加入一层异丁醇厚约1cm，置30-45min,两者之间会出现一条明显的界线，量分离胶的宽度，倒出，冲洗（1×Tris/SDS，PH8.8）未聚合的丙烯酰胺，滤纸（普通）吸干（带手套，Whatman3mm滤纸）。
加入积层胶，插梳子，置30-45min，拔梳子，冲洗（蒸馏水）未聚合的丙烯酰胺，把凝胶固定于电泳装置，加入1×电泳缓冲液，排出凝胶底部两玻板间的气泡（注射器弯90℃），不要预电泳，以免破坏缓冲系统的不连续性。#p#分页标题#e##p#分页标题#e#
加样（冰上）
加样缓冲液用前加50µl β-巯基乙醇**950µl sample buffer（5µl-95µl，10µl-190µl，15µl-285µl，20µl-380µl），sample buffer稀释样品（100µg总蛋白，**少30µg）**少1：2，总体积<25µl（30-45µl），约20µl（可用水试验一下），100℃ 5min,冲洗加样孔，加样，注意加样均匀，水冲洗枪头于餐巾纸。**外侧加等量样品缓冲液，避免边缘效应，或MARK（预染蛋白质marker）加样孔。
电泳和取胶
正负极正确连接，80v，90-120min(1h)，电泳**溴酚蓝到达凝胶底部为止；关闭电源，带手套（防止油脂阻碍蛋白转膜）将胶取出放于一吸水纸上，备盒子，转移液多一点，撬玻璃，浸湿一下，刮下**左边的两个加样齿做标记，玻璃作尺子，切积层胶，垫片挑下，转移缓冲液，摇30min。
电转（带手套，油脂阻碍蛋白转膜）
利用电转缓冲液浸泡滤纸15min，并利用甲醛浸泡PVDF膜5min，再用电转缓冲液浸泡PVDF膜10min，之后按照大滤纸-膜-胶-纸(试管赶气泡)放置于电转设置，于冰中电转，350mA，120min，看电流，取膜，切硝酸纤维膜的右上角标记（参考分子克隆红皮P366）
此步之后可以利用丽春红染液检测转膜效果，并记录蛋白Marker的位置，确定电转效果。然后再利用蒸馏水洗涤多次，可以将丽春红染液洗掉，继续进行下面实验。
封闭
将膜浸于封闭液（含有5％脱脂奶粉，0.1％（v/v）的PBS－T或者TBS－T）中，在水平脱色摇床上，室温2.5h。之后快速利用wash buffer洗涤一次15min,再洗两次各5min。
加入一抗
shou先按要求将一抗利用PBS－T或TBS－T稀释，将PVDF膜放于杂交袋中，按0.1ml/cm²比例加入一抗稀释液，放于4℃冰箱过夜；之后浸于Wash buffer，按照>4ml/cm²室温洗涤一次15min，之后利用新鲜的Wash buffer2×5min洗涤。
加入二抗
将二抗按照要求进行稀释于PBS－T或TBS－T中，室温将膜浸于二抗，放于脱色摇床2.5h，之后和步骤8一样洗涤。
染色
将kit中的solution1和solution2等体积混和，之后按照0.125/cm²等体积覆盖于膜上（蛋白面向上，膜放于平面上），室温放置1min，将膜利用镊子赶走多余的detecton reagent
显影
将膜蛋白面向上，放于X－ray Film cassette,在暗室中将film放于膜上，盖上cassette，5分钟。快速冲洗,之后放于第二个film，放置10min.将冲洗的胶片放于室温凉干。
2007-09-29 | 定量PCR技术思考 

定量PCR现在已经是一种常规的生物学实验技术手段，俺也有相当一段时间采用这种技术来分析基因的表达。现将此技术与大家分享。
其实我认为定量PCR**常用的是相对定量，其实和我们以前的半定量PCR一样，只是此技术的升级版本。定量PCR**大的麻烦是特异性和污染问题。
特异性主要当然是引物的设计，所以我主张：
shou先采用别人发表的引物为佳。当然采用的paper的级别要高点为好，例如PNAS以上等，这样的可信度高。
其次就是自己设计，设计的原则在takara的定量PCR宣传册已经非常的详细，但是一般来说很难能够达到完全符合要求。这样**好设计两对以上的引物，进行定量PCR。定量PCR是要看溶解曲线的，而且要关心溶解曲线峰的宽度，但是这个不是很准确，从严格的角度来说，还要在定量PCR之后，将产物进行电泳检测，看是否特异。若是特异才可以采用这种方法。
再次，内参我认为**少应该采用两个，因为现在发现很多的药物等可以改变beta－actin的表达。
**后，做此实验时，一定要独立重复，而不是复孔进行实验。
此实验一定要严格带手套进行，以防污染，一旦污染整个实验便没有意义，即使只是一点点污染。

软琼脂克隆法与裸鼠体内接种法检测细胞致瘤性的比较